飼料及び飼料添加物の成分規格等に関する省令

対象飼料		鶏（ブロイラーを除く。）用		ブロイラー用		豚用		牛用
飼料添加物名	単位	幼すう用・中すう用		前期用	後期用	ほ乳期用	子豚期用	ほ乳期用	幼齢期用	肥育期用
亜鉛バシトラシン	万単位	16.8〜168		16.8〜168	16.8〜168	42〜420	16.8〜168	42〜420	16.8〜168
アビラマイシン	ｇ力価	2.5〜10		2.5〜10	2.5〜10	10〜40	5〜40
アルキルトリメチルアンモニウムカルシウムオキシテトラサイクリン	ｇ力価	5〜55		5〜55		5〜70		20〜50	20〜50
エフロトマイシン	ｇ力価					2〜16	2〜16
エンラマイシン	ｇ力価	1〜10		1〜10	1〜10	2.5〜20	2.5〜20
クロルテトラサイクリン	ｇ力価	10〜55		10〜55				10〜50	10〜50
サリノマイシンナトリウム	ｇ力価	50		50	50				15	15
セデカマイシン	ｇ力価					5〜20	5〜20
センデュラマイシンナトリウム	ｇ力価	25		25	25
ナラシン	ｇ力価	80		80	80
ノシヘプタイド	ｇ力価	2.5〜10		2.5〜10	2.5〜10	2.5〜20	2.5〜20
バージニアマイシン	ｇ力価	5〜15		5〜15	5〜15	10〜20	10〜20
ビコザマイシン	ｇ力価	5〜20		5〜20	5〜20	5〜20	5〜20
フラボフォスフォリポール	ｇ力価	1〜5		1〜5	1〜5	2〜10	2.5〜5
モネンシンナトリウム	ｇ力価	80		80	80				30	30
ラサロシドナトリウム	ｇ力価	75		75	75					33
硫酸コリスチン	ｇ力価	2〜20		2〜20	2〜20	2〜40	2〜20	20
リン酸タイロシン	ｇ力価					11〜44
アンプロリウム・エトパベート	ｇ	ｱﾝﾌﾟﾛﾘｳﾑ	40〜250	40〜250	40〜250
		ｴﾄﾊﾟﾍﾞｰﾄ	2.56〜16	2.56〜16	2.56〜16
アンプロリウム・エトパベート・スルファキノキサリン	ｇ	ｱﾝﾌﾟﾛﾘｳﾑ	100	100	100
		ｴﾄﾊﾟﾍﾞｰﾄ	5	5	5
		ｽﾙﾌｧｷﾉｷｻﾘﾝ	60	60	60
クエン酸モランテル	ｇ					30	30
デコキネート	ｇ	20〜40		20〜40	20〜40
ナイカルバジン	ｇ			100
ハロフジノンポリスチレンスルホン酸カルシウム	ｇ	40		40	40

鶏（ブロイラーを除く。）用	幼すう用	ふ化後おおむね４週間以内の鶏用飼料
	中すう用	ふ化後おおむね４週間を超え10週間以内の鶏用飼料
ブロイラー用	前期用	ふ化後おおむね３週間以内のブロイラー用飼料
	後期用	ふ化後おおむね３週間を超え食用として屠殺する前７日までのブロイラー用飼料
豚用	ほ乳期用	体重がおおむね30kg以内の豚用飼料
	子豚期用	体重がおおむね30kgを超え70kg以内の豚（種豚育成中のものを除く。）用飼料
牛用	ほ乳期用	生後おおむね３月以内の牛用飼料
	幼齢期用	生後おおむね３月を超え６月以内の牛用飼料
	肥育期用	生後おおむね６月を超えた肥育牛（搾乳中のものを除く。）用飼料

第 １ 欄	第 ２ 欄	第 ３ 欄
γ−ＢＨＣ	牧草	0.4ppm
２，４−Ｄ	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.5ppm 0.5ppm 0.5ppm 0.05ppm 0.5ppm 0.5ppm 260ppm
ＢＨＣ(α−ＢＨＣ、β−ＢＨＣ、γ−ＢＨＣ及びδ−ＢＨＣの総和をいう。)	牧草	0.02ppm
ＤＤＴ（ＤＤＤ及びＤＤＥを含む。）	牧草	0.1ppm
アセフェート	とうもろこし 牧草	0.5ppm 3ppm
アトラジン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.02ppm 0.02ppm 0.3ppm 0.2ppm 0.02ppm 0.02ppm 15ppm
アラクロール	えん麦 大麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.1ppm 0.05ppm 0.2ppm 0.1ppm 0.05ppm 3ppm
アルジカルブ	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.02ppm 0.02ppm 0.05ppm 0.2ppm 0.02ppm 1ppm
アルドリン及びディルドリン（総和をいう。）	牧草	0.02ppm
イソフェンホス	とうもろこし	0.02ppm
イミダクロプリド	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.1ppm 0.05ppm 0.05ppm 6ppm
エチオン	牧草	20ppm
エンドリン	牧草	0.01ppm
カルタップ、チオシクラム及びベンスルタップ（総和をいう。）	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.7ppm
カルバリル	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	10ppm 5ppm 2ppm 0.1ppm 10ppm 5ppm 250ppm
カルベンダジム、チオファネート、チオファネートメチル及びベノミル（総和をいう。）	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.6ppm 0.6ppm 0.6ppm 0.7ppm 0.6ppm 0.6ppm 10ppm
カルボフラン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.1ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.05ppm 0.1ppm 0.1ppm 13ppm
キャプタン	とうもろこし	10ppm
グリホサート	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	20ppm 20ppm 5ppm 1ppm 20ppm 0.2ppm 120ppm
グルホシネート	大麦 小麦 とうもろこし 牧草	5ppm 0.2ppm 0.1ppm 15ppm
クロルピリホス	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.75ppm 0.2ppm 0.5ppm 0.1ppm 0.75ppm 0.01ppm 13ppm
クロルピリホスメチル	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	10ppm 6ppm 10ppm 7ppm 10ppm 7ppm
クロルフェンビンホス	小麦 とうもろこし	0.05ppm 0.05ppm
クロルプロファム	大麦 小麦 とうもろこし ライ麦	0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm
クロルベンジレート	とうもろこし	0.02ppm
シアナジン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.01ppm 0.05ppm 0.1ppm 0.1ppm 0.01ppm 0.01ppm 0.01ppm
ジカンバ	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	3ppm 0.5ppm 0.5ppm 0.5ppm 3ppm 0.1ppm 200ppm
ジクロルボス及びナレド（総和をいう。）	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 10ppm
ジクワット	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	2ppm 5ppm 2ppm 0.05ppm 2ppm 0.03ppm 100ppm
シハロトリン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.2ppm 0.05ppm 0.04ppm 0.2ppm 0.02ppm 0.6ppm
シフルトリン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 3ppm
シマジン	とうもろこし 牧草	0.3ppm 9ppm
ジメトエート	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.04ppm 0.05ppm 1ppm 0.2ppm 0.2ppm 2ppm
ダイアジノン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.1ppm 0.1ppm 0.1ppm 0.02ppm 0.1ppm 0.1ppm 10ppm
チアベンダゾール	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.05ppm 0.05ppm 0.5ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 10ppm
デルタメトリン及びトラロメトリン（総和をいう。）	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	1ppm 1ppm 1ppm 1ppm 1ppm 1ppm 5ppm
テルブホス	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.05ppm 0.01ppm 0.01ppm 0.01ppm 0.05ppm 0.005ppm 1ppm
トリシクラゾール	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm 5ppm
二臭化エチレン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	0.01ppm 0.01ppm 0.1ppm 0.01ppm 0.01ppm 0.01ppm
パラコート	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.5ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.1ppm 0.5ppm 0.05ppm 5ppm
パラチオン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.08ppm 0.5ppm 0.3ppm 0.3ppm 0.08ppm 0.05ppm 5ppm
ピペロニルブトキシド	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	24ppm 24ppm 24ppm 24ppm 24ppm 24ppm
ピリミホスメチル	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	1ppm 1ppm 1ppm 1ppm 1ppm 1ppm
フィプロニル	牧草	0.2ppm
フェニトロチオン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	1ppm 5ppm 10ppm 1ppm 1ppm 1ppm 10ppm
フェノブカルブ	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	0.3ppm 0.3ppm 0.3ppm 0.3ppm 0.3ppm 0.3ppm
フェンチオン	とうもろこし	5ppm
フェントエート	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	0.4ppm 0.4ppm 0.4ppm 0.4ppm 0.4ppm 0.4ppm
フェンバレレート	牧草	13ppm
フェンプロパトリン	牧草	20ppm
ブロモキシニル	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.1ppm
ヘプタクロル	牧草	0.02ppm
ペルメトリン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 2ppm 55ppm
ベンタゾン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 3ppm
ペンディメタリン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.1ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.2ppm 0.1ppm 0.2ppm 0.1ppm
ホスメット	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 40ppm
ホレート	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 0.05ppm 1.5ppm
マラチオン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	2ppm 2ppm 8ppm 2ppm 2ppm 2ppm 135ppm
メチダチオン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦 牧草	0.2ppm 0.02ppm 0.02ppm 0.1ppm 0.2ppm 0.02ppm 12ppm
メトプレン	えん麦 大麦 小麦 とうもろこし マイロ ライ麦	5ppm 5ppm 5ppm 5ppm 5ppm 5ppm
備考 　１　第２欄に掲げる飼料の原料は、次に掲げる区分に応じ、それぞれ次に定める部位をいう。 　　　(1)　えん麦、大麦及びマイロ　　 脱穀した種子 　　　(2)　小麦及びライ麦 玄麦 　　　(3)　とうもろこし 外皮、ひげ及びしんを除いた種子 　　　(4)　牧草 茎葉及び脱穀前の種子 　２　「牧草」には、乾燥して水分含量を低下させたもの及びサイレージ（牧草（乾燥して水分含量を低下させたものを含む。）をサイロ又は適当な容器に詰め、乳酸発酵させて調製する飼料をいう。）を含む。 　３　第２欄に掲げる飼料の原料が牧草である場合において、第１欄に掲げる農薬の成分である物質の当該飼料の原料中の含有量を算出するに当たつては、当該飼料の原料中の水分の含有量が10％を超えるときは、その超える量を当該飼料の原料の量から除外するものとする。

第 １ 欄	第 ２ 欄	第 ３ 欄
γーＢＨＣ	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.4ppm 0.05ppm 0.05ppm
ＢＨＣ(α−ＢＨＣ、β−ＢＨＣ、γ−ＢＨＣ及びδ−ＢＨＣの総和をいう。)	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.005ppm 0.005ppm 0.005ppm
ＤＤＴ（ＤＤＤ及びＤＤＥを含む。）	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.1ppm 0.1ppm 0.1ppm
アルドリン及びディルドリン（総和をいう。）	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm
エンドリン	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.01ppm 0.01ppm 0.01ppm
フィプロニル	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.02ppm 0.02ppm 0.01ppm
フェンバレレート	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	8ppm 4ppm 0.5ppm
ヘプタクロル	牛、めん羊、山羊及びしか 豚 鶏及びうずら	0.02ppm 0.02ppm 0.02ppm

第１欄	アンプロリウム・エトパベート、アンプロリウム・エトパベート・スルファキノキサリン、サリノマイシンナトリウム、センデュラマイシンナトリウム、デコキネート、ナイカルバジン、ナラシン、ハロフジノンポリスチレンスルホン酸カルシウム、モネンシンナトリウム、ラサロシドナトリウム
第２欄	クエン酸モランテル
第３欄	亜鉛バシトラシン、アビラマイシン、アルキルトリメチルアンモニウムカルシウムオキシテトラサイクリン、エフロトマイシン、エンラマイシン、クロルテトラサイクリン、セデカマイシン、ノシヘプタイド、バージニアマイシン、フラボフォスフォリポール、リン酸タイロシン
第４欄	アルキルトリメチルアンモニウムカルシウムオキシテトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ビコザマイシン、硫酸コリスチン

飼料添加物名	対象飼料
エンテロコッカス　フェカーリス（クロストリジウム　ブチリカム（その２）製剤及びバチルス　サブチルス（その４）製剤と混合して使用する場合に限る。）	牛用、豚用及び鶏用
エンテロコッカス　フェシウム（その１）（ラクトバチルス　アシドフィルス（その１）製剤と混合して使用する場合に限る。）	牛用及び鶏用
エンテロコッカス　フェシウム（その２）（ラクトバチルス　アシドフィルス（その６）製剤と混合して使用する場合に限る。）	豚用
エンテロコッカス　フェシウム（その３）	牛用、豚用及び鶏用
エンテロコッカス　フェシウム（その４）（ビフィドバクテリウム　サーモフィラム（その２）製剤及びラクトバチルス　アシドフィルス（その５）製剤と混合して使用する場合に限る。）	牛用及び豚用
クロストリジウム　ブチリカム（その１）	牛用、豚用及び鶏用
バチルス　コアグランス	豚用
バチルス　サブチルス（その１）	牛用、豚用及び鶏用
バチルス　サブチルス（その２）	牛用、豚用及び鶏用
バチルス　サブチルス（その３）	牛用、豚用及び鶏用
バチルス　セレウス	牛用、豚用、鶏用及び養殖水産動物用
バチルス　バディウス	豚用
ビフィドバクテリウム　サーモフィラム（その１）（ラクトバチルス　サリバリウス製剤と混合して使用する場合に限る。）	鶏用
ビフィドバクテリウム　サーモフィラム（その３）	牛用及び豚用
ビフィドバクテリウム　サーモフィラム（その４）	牛用
ビフィドバクテリウム　シュードロンガム（その１）	豚用
ビフィドバクテリウム　シュードロンガム（その２）	牛用及び豚用
ラクトバチルス　アシドフィルス（その２）	鶏用
ラクトバチルス　アシドフィルス（その３）	牛用
ラクトバチルス　アシドフィルス（その４）	豚用
ラクトバチルス　アシドフィルス（その５）	牛用及び豚用
ラクトバチルス　アシドフィルス（その６）	豚用

飼料添加物名	名称
Ｌ−アスコルビン酸	ビタミンＣ
Ｌ−アスコルビン酸カルシウム	ビタミンＣ
Ｌ-アスコルビン酸ナトリウム	ビタミンＣ
Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム	ビタミンＣ
アセトメナフトン	ビタミンＫ４
アミノ酢酸	グリシン
アミラーゼ	でんぷん分解酵素
ＤＬ−アラニン	アラニン
アルカリ性プロテアーゼ	たん白質分解酵素
アルキルトリメチルアンモニウムカルシウムオキシテトラサイクリン	オキシテトラサイクリン第四級アンモニウム塩
アルギン酸ナトリウム	粘結剤
エルゴカルシフェロール	ビタミンＤ２
塩化コリン	コリン
塩酸ジベンゾイルチアミン	ビタミンＢ１
塩酸チアミン	ビタミンＢ１
塩酸ピリドキシン	ビタミンＢ６
塩酸Ｌ−リジン	リジン
エンテロコッカス　フェカーリス	乳酸菌
エンテロコッカス　フェシウム	乳酸菌
カゼインナトリウム	粘結剤
カルボキシメチルセルロースナトリウム	粘結剤
キシラナーゼ	繊維分解酵素
キシラナーゼ・ペクチナーゼ複合酵素	繊維・ペクチン分解酵素
グリセリン脂肪酸エステル	乳化剤
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム	グルタミン酸ナトリウム
クロストリジウム　ブチリカム	酪酸菌
コレカルシフェロール	ビタミンＤ３
酢酸ｄｌ−α−トコフェロール	ビタミンＥ
酸性プロテアーゼ	たん白質分解酵素
シアノコバラミン	ビタミンＢ１２
ジブチルヒドロキシトルエン	ＢＨＴ
硝酸チアミン	ビタミンＢ１
ショ糖脂肪酸エステル	乳化剤
セルラーゼ	繊維分解酵素
セルラーゼ・プロテアーゼ・ペクチナーゼ複合酵素	繊維・たん白質・ペクチン分解酵素
ソルビタン脂肪酸エステル	乳化剤
中性プロテアーゼ	たん白質分解酵素
２−デアミノ−２−ヒドロキシメチオニン	メチオニン水酸化体
ＤＬ−トリプトファン	トリプトファン
Ｌ−トリプトファン	トリプトファン
Ｌ−トレオニン	トレオニン
ＤＬ−トレオニン鉄	トレオニン鉄
ニコチン酸アミド	ニコチン酸
バチルス　サブチルス	枯草菌
Ｄ−パントテン酸カルシウム	パントテン酸
ＤＬ−パントテン酸カルシウム	パントテン酸
ｄ−ビオチン	ビオチン
ビタミンＡ粉末	ビタミンＡ
ビタミンＡ油	ビタミンＡ
ビタミンＤ粉末	ビタミンＤ
ビタミンＤ３油	ビタミンＤ３
ビタミンＥ粉末	ビタミンＥ
ビフィドバクテリウム　サーモフィラム	ビフィズス菌
ビフィドバクテリウム　シュードロンガム	ビフィズス菌
ブチルヒドロキシアニソール	ＢＨＡ
プロピレングリコール	粘結剤
ポリアクリル酸ナトリウム	粘結剤
ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル	乳化剤
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル	乳化剤
ＤＬ−メチオニン	メチオニン
メナジオン亜硫酸水素ジメチルピリミジノール	ビタミンＫ３
メナジオン亜硫酸水素ナトリウム	ビタミンＫ３
ラクターゼ	乳糖分解酵素
ラクトバチルス　アシドフィルス	乳酸菌
ラクトバチルス　サリバリウス	乳酸菌
リパーゼ	脂肪分解酵素
リボフラビン	ビタミンＢ２
リボフラビン酪酸エステル	ビタミンＢ２
硫酸亜鉛（乾燥）	硫酸亜鉛
硫酸亜鉛（結晶）	硫酸亜鉛
硫酸コバルト（乾燥）	硫酸コバルト
硫酸コバルト（結晶）	硫酸コバルト
硫酸鉄（乾燥）	硫酸鉄
硫酸銅（乾燥）	硫酸銅
硫酸銅（結晶）	硫酸銅
硫酸ナトリウム（乾燥）	硫酸ナトリウム
硫酸マグネシウム（乾燥）	硫酸マグネシウム
硫酸マグネシウム（結晶）	硫酸マグネシウム
硫酸Ｌ−リジン	リジン
リン酸一水素カリウム（乾燥）	リン酸一水素カリウム
リン酸一水素ナトリウム（乾燥）	リン酸一水素ナトリウム
リン酸二水素カリウム（乾燥）	リン酸二水素カリウム
リン酸二水素ナトリウム（乾燥）	リン酸二水素ナトリウム
リン酸二水素ナトリウム（結晶）	リン酸二水素ナトリウム

定量法Ａ

　薄層クロマトグラフィー用ワコーゲルＢ−Ｏ　30ｇに水60mLを加え十分に混合して、アプリケーターで薄層クロマト用ガラス板（20×20cm）に0.25mmの厚さに塗布し、風乾した後、110〜120ﾟで２時間加熱して活性化する。

　試料20ｇ（1000μmの網ふるいを通過させたもの）を500mLの分液漏斗にとり、水10mL及びクロロホルム100mLを加えて振とう機で30分間振り混ぜる。クロロホルム層をろ紙でろ過して試料液とする。

　薄層板の一辺から３cm離れた位置をベースラインとし、ベースライン上に試料液を５、10、15、20μL及び標準アフラトキシン混合液及び標準アフラトキシンB₁液各10μLマイクロシリンジで１〜1.5cm間隔にスポットし、展開液

の先端が10cm以上になるよう展開する。

　展開した後薄層板をとり出し、風乾して展開液を揮散させる。

　展開し風乾した薄層板をけい光検出装置の紫外灯の直下に置き、試料液の展開スポットに標準アフラトキシンＢ_１のＲｆと一致するけい光スポットがあるかを判定する。

　すべての試料液の展開スポットにアフラトキシンＢ_１によるけい光が認められた場合には、試料液の数mLをクロロホルムで適宜希釈して、その液の10又は15μLの展開スポットに確認し得る最低のけい光強度（検出限界量という。以下同じ。）が得られるよう一定容量に調製する。

　この分析条件におけるアフラトキシンＢ_１の検出限界量は、0.4×10-9ｇである。

　アフラトキシンＢ_１量は、次式により算出する。

アフラトキシンＢ_１（μg/kg）＝（400×Ｓ）÷（Ｗ×Ｖ）

Ｗ　落花生油かすの量（20ｇ）

Ｖ　検出限界量を示した試料液のスポット量（μL）

注

定量法Ｂ

　定量法Ａ・ｄ・1)で調製した試料液の一定量（10〜20μL）及び標準アフラトキシン混合液10μLを薄層板にスポットし、同時に検量線作成のため、標準アフラトキシンＢ_１液を４濃度段階にスポットする。

　薄層板の調製及び展開分離の方法は、定量法Ａ・ｃ及びＡ・ｄ・2)による。

　展開し風乾した後、デンシトメーター（カットフイルター390nm、励起波長365nm、けい光波長430nm）により標準アフラトキシンＢ_１液の展開スポット及び試料液のアフラトキシンＢ_１スポットのけい光強度を測定し、標準アフラトキシンＢ_１液の展開スポットのけい光強度から作成した検量線によって試料液中のアフラトキシンＢ_１量を求め、試料中のアフラトキシンＢ_１量を算出する。

飼料の種類	配合割合
鶏用（幼すう用及びブロイラー前期用を除く。）飼料	４％以下
豚用（ほ乳期用を除く。）飼料	４％以下
搾乳牛用飼料	２％以下
牛用（ほ乳期用及び搾乳牛用を除く。）飼料	４％以下

　落花生油かすのみを単体で使用してはならない。

事項	尿素	ジウレイドイソブタン
種類
純度 水分 ビウレット 尿素 重金属	97％以上 0.5％以下 1.0％以下 − 10ppm以下	93％以上 2.0％以下 − 3.0％以下 10ppm以下

　この場合の尿素及びジウレイドイソブタンの試験法は、それぞれ次のとおりとする。

○尿素の試験法

Ａ　純度

　ケルダール法によって求めた窒素の量からビウレット性窒素の量を減じ、純度を算出する。

尿素の純度（％）＝｛（ａ−ｂ）÷46.65｝×100

ａ　ケルダール法によって求めた窒素の量

ｂ　ビウレット性窒素の量

46.65　尿素中の窒素量の理論値

Ｂ　水分

　試料約５ｇをひよう量ざらに正確にとり、75±１ﾟで４時間乾燥し、その減量を水分とする。

Ｃ　ビウレット

ａ　試薬の調製

1)　標準ビウレット性窒素液

　ビウレット〔（CO・NH₂）₂NH〕（110ﾟで恒量になるまで乾燥したもの）0.9813ｇを100mLのメスフラスコにとり、水に溶かし更に標線まで水を加える（この液１mLは、ビウレット性Ｎとして４mgを含有する）。

2)　硫酸銅液

　硫酸銅15ｇを水に溶かして１Ｌとし、必要があればろ過する。

ｂ　試料液の調製

　試料約１〜10ｇ（ビウレット性Ｎとして20〜60mgがよい。）を100mLのメスフラスコに正確にとり、水約50mLを加えて溶かす。

ｃ　定量

　試料液に４％水酸化ナトリウム液20mLを加え、更に硫酸銅液20mLを加えて発色させ、標線まで水を加えてよく振り混ぜ、約30分間放置後、遠心機により沈でんを分離し、その上澄み液をとり波長540nm付近の吸光度を測定する。別に標準ビウレット性窒素液の各種一定量について、試料液の場合と同一条件で操作して作成した検量線からビウレット性窒素〔Ｎ〕の量を求める。これに係数2.4531を乗じてビウレットの量とする。

Ｄ　重金属

ａ　試薬の調製

1)　標準鉛液

　特級鉛〔Pb〕１ｇをトールビーカーに正確にとり、硝酸10mL及び水約30mLを加え加熱して溶かし、冷却後水を加えて正確に１Ｌとし、標準鉛原液を調製する（この液１mLは、Pbとして１mgを含有する）。使用に際してこの原液の一定量を水で正確に100倍に希釈する（この液１mLは、Pbとして0.01mgを含有する）。

2)　硫化ナトリウム液

　硫化ナトリウム５ｇを水10mL及びグリセリン30mLの混合液に溶かし、しや光したびんに入れて貯蔵する。

ｂ　検液及び比較液の調製

　試料10ｇをネスラー管にとり、水適量を加えて溶かし、40mLとし、これに１mol/L酢酸２mL及び水を加えて50mLとする（この液を検液とする）。

　別に標準鉛液1.0mLをネスラー管にとり、１mol/L酢酸２mL及び水を加えて50mLとする（この液を比較液とする）。

ｃ　操作

　検液及び比較液に硫化ナトリウム液１滴ずつを加えて混和し、５分間放置した後、両管を白色の背景を用い、上方又は側方から観察して液の色を比較する。

　検液の呈する色は、比較液の呈する色より濃いものでないこと。

○ジウレイドイソブタンの試験法

Ａ　純度

ａ　装置及び器具

1)　ガスクロマトグラフ

　水素炎イオン化検出器付ガスクロマトグラフ

2)　耐圧フラスコ

　250mLの共せん付耐圧フラスコで、せんはスプリングで固定できるもの。

3)　カラム

　内径　３mm、長さ　３ｍ、ステンレス製又はガラス製

ｂ　試薬

1)　標準ジウレイドイソブタン

　ジウレイドイソブタンを約90ﾟの熱水で２回再結晶を行い、結晶の倍量のメタノールで洗浄し、真空乾燥する。

2)　酢酸エチル

　特級酢酸エチルを無水硫酸ナトリウムで脱水後、蒸留した主留分を用いる。

3)　pH1.0緩衝液

　１mol/L酢酸ナトリウム液200mL、１mol/L塩酸300mL及び水500mLを混合し、pH1.0に調節する。

ｃ　ガスクロマトグラフィーの条件

1)　カラム充てん剤　ジオクチルフタレート25％セライト545

2)　カラム温度　90ﾟ

3)　試料気化室温度　120ﾟ

4)　キャリアーガス　N₂

5)　流速　40mL/min

6)　水素炎　空気1.0kg/cm²　水素70mL/min

ｄ　操作

　試料の一定量（ジウレイドイソブタンとして約0.2ｇ）を耐圧フラスコに正確にとり、pH1.0緩衝液100mL及びトルエン20mLを加え、テフロン製マグネット棒を入れ、せんをスプリングで固定する。これを約40ﾟの水浴に浸し、マグネティックスターラーで20分間激しくかき混ぜた後、氷水中に移し５分間かき混ぜて冷却する。

　直ちに内部標準物質として酢酸エチル0.25mLを注射器でとり、針にゴムせんを付け重量を量つた後、冷却した分解液に加え（注射器の重量を量り、その減量から酢酸エチルの採取量を求めておく。）、激しく振り混ぜた後トルエン層12〜13mLと無水硫酸ナトリウム４ｇを遠沈管にとりせんをして遠心機にかけ、分離したトルエン層をガスクロマトグラフィーに供する。

　別に標準ジウレイドイソブタン0.15ｇ、0.20ｇ、0.25ｇをそれぞれ耐圧フラスコに正確にとり、pH1.0緩衝液100mL及びトルエン20mLを加え、以下試料と同様に操作を行う。

ｅ　計算

Ｂ　水分

　試料約５ｇをひよう量ざらに正確にとり、75±１ﾟで４時間乾燥し、その減量を水分とする。

Ｃ　尿素

ａ　試料液の調製

　試料約５ｇを500mLのメスフラスコに正確にとり、水約400mLを加え、１分間30〜40回転の振り混ぜ機で30分間振り混ぜた後、標線まで水を加え、乾燥ろ紙でろ過する。

ｂ　定量

　試料液50mLを蒸留フラスコに正確にとり、メチルレッドを指示薬として0.5％水酸化ナトリウム液で中和し（pH5.6〜5.8）、尿素を分解するのに十分な量のウレアーゼを加え、密せんして40〜45ﾟの水浴中に１時間作用させた後冷却する。この分解液に酸化マグネシウム２〜３ｇ及び少量のシリコン油を加え、標準硫酸液20mLを正確に入れた受器を接続した水蒸気蒸留装置に連結する。以下粗たん白質の定量法により滴定し、別にウレアーゼの空試験を行い、滴定値を補正した後、尿素性窒素〔Ｎ〕の量を求める。これに係数2.1438を乗じて尿素の量とする。

Ｄ　重金属

ａ　試薬の調製

　尿素の試験法のＤのａによる。

ｂ　検液及び比較液の調製

　試料2.0ｇを石英製又は磁製るつぼにとり、初めは弱く加熱し、次いで強熱しで灰化する。冷後、王水１mLを加え水浴上で蒸発乾固し、残留物を塩酸３滴で潤し、熱湯10mLを加えて２分間加熱する。

　次にフェノールフタレインを指示薬とし、10％アンモニア水を液が微赤色となるまで滴加し、１mol/L酢酸２mLを加え、必要があればろ過し、水10mLで洗い、ろ液及び洗液をネスラー管に入れ、水を加えて50mLとする（この液を検液とする）。

　別に王水１mLを水浴上で蒸発乾固し、以下検液の調製法と同様に操作し、標準鉛液2.0mL及び水を加えて50mLとする（この液を比較液とする）。

ｃ　操作

　検液及び比較液に硫化ナトリウム液１滴ずつを加えて混和し、５分間放置した後、両管を白色の背景を用い、上方又は側方から観察して液の色を比較する。

　検液の呈する色は、比較液の呈する色より濃いものでないこと。

原料	飼料の種類	配合割合
尿素	牛用飼料（生後おおむね６月を超えた牛用飼料に限る。）	２．０％以下
ジウレイドイソブタン	牛用飼料（搾乳牛以外の生後おおむね６月を超えた牛用飼料に限る。）	１．５％以下

　アンモニアと二酸化炭素を高温、高圧で反応させて製造する。この場合、その製造工程中に触媒、固結防止剤その他の物を用いてはならない。

　尿素とイソブチルアルデヒドを硫酸酸性で反応させて製造する。この場合、その製造工程中に硫酸以外の触媒及び水酸化ナトリウム以外の中和剤を用いてはならない。製品の粒径は、840μmの網ふるいを通過するものでなければならない。

　尿素及びジウレイドイソブタンは、同一飼料の原料として用いてはならない。

　尿素及びジウレイドイソブタンは、それぞれ単体で使用してはならない。

　尿素及びジウレイドイソブタンは、湿気の多い場所に保存してはならない。

　保存に当たつては、吸湿等による品質の低下をきたさないよう配慮すること。

　試料約20ｇを精密に量り^注１）、特級石油エーテル200mLを加えて溶かした後、重量既知のガラスろ過器（Ｇ３^注２））でろ過し^注３）、ろ過器上の残留物を特級石油エーテル200mLで十分に洗浄する。残留物の入ったガラスろ過器を105±１°で１時間乾燥し、デシケーター（シリカゲル）で30分間放冷した後、重量を精密に量り、次式により不溶性不純物の含有量を算出する。

不溶性不純物（％）＝（Ｗ３−Ｗ２）÷Ｗ１×100

Ｗ１：試料採取量（ｇ）

Ｗ２：ガラスろ過器の重量（ｇ）

Ｗ３：残留物の入ったガラスろ過器の重量（ｇ）

注

使用上及び保存上の注意

メートル	ｍ		センチメートル	cm
ミリメートル	mm		マイクロメートル	μm
ナノメートル	nm		平方センチメートル	cm2
リットル	Ｌ		ミリリットル	mL
マイクロリットル	μL		トン	ｔ（1,000kg）
キログラム	kg		グラム	ｇ
ミリグラム	mg		マイクログラム	μg
キロパスカル	kPa

用　　　語	溶質１ｇ又は１mLを溶かすに要する溶媒量
きわめて溶けやすい	１mL未満
溶けやすい	１mL以上	10mL未満
やや溶けやすい	10mL以上	30mL未満
やや溶けにくい	30mL以上	100mL未満
溶けにくい	100mL以上	1,000mL未満
きわめて溶けにくい	1,000mL以上	10,000mL未満
ほとんど溶けない	10,000mL以上

濁度標準原液　0.1mol/L塩酸14.1mLに水を加えて50mLとする。この液１mLはCl１mgを含む。

濁度標準溶液　濁度標準原液10mLに水を加えて1,000mLとする。この液１mLはCl0.01mgを含む。

　飼料添加物が組換えＤＮＡ技術によつて得られた生物を利用して製造されたものを含む場合は、当該飼料添加物は、その安全性につき、農林水産大臣の定めるところにより、農林水産大臣の確認を受けたものでなければならない。

スルホン酸硫黄　5.0％以上

カルシウム　7.0％以下

50％溶液の粘度　3,000センチポアズ以下

鉛　１mg/kg以下

還元糖　30.0％以下

乾燥減量　10.0％以下

強熱残分　20.0％以下

スルホン酸硫黄　5.0％以上

ナトリウム　10.0％以下

50％溶液の粘度　3,000センチポアズ以下

鉛　１mg/kg以下

還元糖　30.0％以下

乾燥減量　10.0％以下

強熱残分　20.0％以下

６　飼料添加物一般の試験法

　一般試験法は、共通な試験法及びこれに関連する事項をまとめたものである。別に規定する場合を除き、液体クロマトグラフ法、塩化物試験法、炎色反応試験法、ガスクロマトグラフ法、乾燥減量試験法、吸光度測定法、凝固点測定法、強熱減量試験法、強熱残分試験法、屈折率測定法、原子吸光光度法、抗菌活性試験法、抗生物質の力価試験法、酵素力試験法、１，４−ジオキサン試験法、重金属試験法、水分定量法、生菌剤試験法、生菌剤定量法、赤外吸収スペクトル測定法、旋光度測定法、粗脂肪定量法、粗繊維定量法、窒素定量法、定性反応、鉛試験法、バイオオートグラフ法、薄層クロマトグラフ法、ｐＨ測定法、比重測定法、ヒ素試験法、ビタミンＡ定量法、ビタミンＤ定量法、沸点測定法及び蒸留試験法、融点測定法、硫酸塩試験法、硫酸呈色物試験法並びにろ紙クロマトグラフ法は、それぞれ規定するところにより行う。

(1) 液体クロマトグラフ法

　液体クロマトグラフ法は、固定相として適当な充てん剤を詰めたカラム中に、移動相として液体をポンプ等で加圧して流すことにより、カラムに注入された混合物を固定相に対する保持力の差を利用してそれぞれの成分に分離、分析する方法であつて、液体試料又は溶液にできる試料に適用でき、物質の確認、純度の試験又は定量等に用いる。

　カラムに注入された混合物は各成分に固有の比率で、移動相と固定相とに分布する。この比を質量分布比ｋ′という。

　ｋ′＝固定相に存在する量／移動相に存在する量

　質量分布比と保持時間ｔ_Ｒ（試料注入時よりピークの頂点が溶出されるまでの時間）との間には次の関係があるので、同一カラムについては温度と移動相の組成及び流量が一定の場合保持時間は物質に固有の値となる。

　ｔ_Ｒ＝（１＋ｋ′）ｔ_０

　　ｔ_０：ｋ′＝０の物質の試料注入時からピーク頂点までの時間

装置

　通例、移動相送液用ポンプ、試料導入部、カラム、検出器及び記録装置よりなり、必要に応じてカラムは恒温槽により恒温に保たれる。ポンプはカラム及び連結チューブの中を一定量で移動相を送液できるものである。カラムは液体クロマトグラフ法用に調製した粒径が、通例、３〜５０μｍの一定の大きさにそろえた充てん剤を、通例、内径２〜８ｍｍ、長さ１０〜１００ｃｍの管に均一に充てんしたものである。 なお、別に規定するもののほか、次の式で定義される分離度Ｒ_Ｓを各条に規定する。

　Ｒ_Ｓ＝２（ｔ_Ｒ１−ｔ_Ｒ２）／１．６７（Ｗh_１＋Ｗh_２）

　ｔ_Ｒ１，ｔ_Ｒ２：分離度測定を用いる２つの物質の保持時間

　Ｗh_１，Ｗh_２：各ピークのピーク高さの中点におけるピーク幅

　検出器は、通例、紫外及び可視の吸光光度計、示差屈折計、蛍光光度計等移動相とは異なる試料の性質を検出するものであり、通例、数μｇ以下の試料に対して濃度に比例した信号を出すものである。検出器によつて得られる信号の強さは記録装置により記録される。

操作法

　装置をあらかじめ調整した後、各条に規定する条件で検出器、カラム、移動相を用い、移動相を一定流量で流してカラムを規定の温度で平衡にした後、各条に規定する方法で調製した試料溶液をマイクロシリンジ又は試料バルブを用いて試料注入部より注入する。分離された成分を検出器により検出し、記録装置を用いてクロマトグラムとして記録させる。試料の確認は保持時間が一致すること又は標準試料を添加してピークの幅が拡がらないことで行う。定量は、通例、内部標準法によるが、適当な内部標準物質の得られない場合は絶対検量線法による。

�@　内部標準法

　被検成分になるべく近い保持時間をもち、いずれのピークとも完全に分離する安定な物質を内部標準物質として選び、その一定量に対して標準被検成分を段階的に加えた標準液を数種類調製する。この一定量ずつを注入して得られたクロマトグラムから、被検物質のピーク高さ又はピーク面積と内部標準物質のピーク高さ又はピーク面積との比を求める。この比を縦軸に、標準被検成分の量を横軸にとり、検量線を作成する。この検量線は、通例、原点を通る直線となる。次に同量の内部標準物質を加えた試料溶液を調製し、検量線を作成したときと同一条件でクロマトグラムを記録させ、被検成分のピーク高さ又はピーク面積と、内部標準物質のピーク高さ又はピーク面積との比を求め、検量線を用いて定量を行う。

�A　絶対検量線法

　標準被検成分を段階的にとり、標準溶液を調製し、この一定量ずつを正確に注入する。得られたクロマトグラムから縦軸に標準被検成分のピーク高さ又はピーク面積、横軸に標準被検成分量をとり、検量線を作成する。この検量線は、通例、原点を通る直線となる。次に各条に規定する方法で試料溶液を調製する。次に検量線を作成したときと同一条件でクロマトグラムを記録させ、被検成分のピーク高さ又はピーク面積を測定し、検量線を用いて定量を行う。

　ピーク測定は通例、次のいずれかの方法による。

�@　ピーク高さ法

　ピークの頂点からベースラインへおろした垂線とピークの両すそを結ぶ接線との交点から頂点までの長さを測定する。

�A　ピーク面積法

(2) 塩化物試験法

　塩化物試験法は、試料中に混在する塩化物の限度試験である。

　各条には、塩化物（Ｃｌとして）の限度を（　）内に付記する。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。各条に規定する量の試料をネスラー管にとり、水適量を加えて溶かし、４０ｍＬとする。これに希硝酸６ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとし、検液とする。別に各条に規定する量の０．０１ｍｏｌ／Ｌ塩酸をとり、希硝酸６ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとし、比較液とする。この場合、検液が澄明でないときは、両液を同条件でろ過する。

　検液及び比較液に硝酸銀試液１ｍＬずつを加えて混和し、直射日光を避け、５分間放置した後、黒色の背景を用い、ネスラー管の上方又は側方から観察して混濁を比較する。

　検液の呈する混濁は、比較液の呈する混濁より濃くてはならない。

(3) 炎色反応試験法

　炎色反応試験法は、ある種の金属塩が鋭敏にブンゼンバーナーの無色炎をそれぞれ固有の色に染める性質を利用して、その金属塩の定性を行う方法である。

操作法

　炎色反応の試験に用いる白金線は径約０．８ｍｍで、先端は直線のままで用いる。試料が固体の場合は塩酸少量を加えてかゆ状とし、その少量を白金線の先端約５ｍｍの部分につけ、水平に保つて無色炎中に入れ試験する。また、試料が液体の場合は白金線の先端を試料中に約５ｍｍ浸し、静かに引き上げて、以下固体の場合と同様に試験する。

　炎色反応が持続するとは、その反応が約４秒間持続することをいう。

(4) ガスクロマトグラフ法

　ガスクロマトグラフ法は、適当な固定相を用いて作られた分離管内を、移動相に気体（キャリヤーガス）を用い、混合物を気体状態で展開させて、それぞれの成分に分離する方法であつて、気体試料又は気化しうる液体若しくは固体試料に適用でき、物質の確認、純度の試験又は定量等に用いる。

　固定相に適当な粒度の吸着性担体を用いる場合を気−固クロマトグラフ法といい、適当な粒度の不活性担体を液相で被覆したもの又は毛細管の内壁を液相で被覆したものを用いる場合を気−液クロマトグラフ法という。

装置

　通例、キャリヤーガス送入部、試料送入部、恒温槽に内蔵された分離管、検出器及び記録計からなる。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　装置をあらかじめ調整した後、各条に規定する条件で分離管、検出器、温度及びキャリヤーガス流量を設定し、各条に規定する量の試料溶液又は標準溶液をガスクロマトグラフ用マイクロシリンジを用いて試料送入部から注入し、分離された成分を検出器によつて検出し、記録計を用いてクロマトグラムを描かせる。

　クロマトグラム上の成分のピーク位置は、保持時間（試料溶液を注入してから成分のピークの頂点が現われるまでの時間）又は保持容量（保持時間×キャリヤーガス流量）で表し、これらは一定条件では物質に特有の値を示す。これによつて試料成分の確認を行う。

　また、クロマトグラム上の成分のピーク面積、ピーク高さ等から試料成分の定量を行う。

　定量は通例、次のいずれかの方法による。

�@　内部標準法

　各条に規定する内部標準物質の一定量に対して、標準被検成分の既知量をそれぞれ段階的に加え、標準溶液を調製し、この一定量ずつを注入する。クロマトグラムから縦軸に標準被検成分のピーク面積又はピーク高さと内部標準物質のピーク面積又はピーク高さとの比をとり、横軸に標準被検成分量と内部標準物質量との比又は標準被検成分量をとつて検量線を作成する。

　次に各条に規定する方法で試料溶液を調製する。ただし、試料溶液の調製にはあらかじめ標準溶液の場合と同量の内部標準物質を加える。次に検量線を作成したときと同一条件で得たクロマトグラムから被検成分のピーク面積又はピーク高さと内部標準物質のピーク面積又はピーク高さとの比を求め、検量線から被検成分量を求める。

　内部標準物質としては、そのピークが被検成分のピーク位置になるべく近く、被検成分以外のピークとも完全に分離する安定な物質を用いる。

�A　絶対検量線法

　標準被検成分を段階的にとり、標準溶液を調製し、この一定量ずつを注入する。クロマトグラムから縦軸に標準被検成分のピーク面積又はピーク高さ、横軸に標準被検成分量をとり、検量線を作成する。次に各条に規定する方法で試料溶液を調製する。検量線を作成したときと同一条件でクロマトグラムを描かせ、検量線から被検成分量を求める。この方法は全測定操作を厳密に一定に保つて行う必要がある。

�B　面積百分率法

　クロマトグラムから得られた各成分のピーク面積の総和を１００とし、それに対するそれぞれの成分のピーク面積の比から組成比を求める。ただし、正確な定量値を得るためには、検出器の感度に基づく各成分のピーク面積の補正を行う必要がある。

　ピーク測定は通例、次のいずれかの方法による。

�@　ピーク高さ法

　ピークの頂点からベースラインへおろした垂線とピークの両すそを結ぶ接線との交点から頂点までの長さを測定する。

�A　ピーク面積法

(5) 乾燥減量試験法

　乾燥減量試験法は、試料を各条に規定する条件で乾燥し、その減量を測定する方法である。この方法は乾燥することによつて失われる試料中の水分、結晶水の全部又は一部及び揮発性物質等の量を測定するために用いる。

　各条に、例えば、１．０％以下（１ｇ，１０５ﾟ，４時間）と規定するものは、本品約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで４時間乾燥するとき、その減量が本品１ｇにつき１０ｍｇ以下であることを示し、また、０．５％以下（１ｇ，減圧，五酸化リン，４時間）と規定するものは、本品約１ｇを精密に量り、五酸化リンを乾燥剤としたデシケーターに入れ、４時間減圧乾燥するとき、その減量が本品１ｇにつき、５ｍｇ以下であることを示す。

操作法

　はかりびんをあらかじめ各条に規定する方法に準じて３０分間乾燥し、その重量を精密に量る。試料は各条に規定する量の±１０％の範囲内で採取し、はかりびんに入れ、別に規定する場合を除き、その層が５ｍｍ以下になるように広げた後、その重量を精密に量り、これを乾燥器に入れ、各条に規定する条件で乾燥する。試料が大きいときは、手早く粉砕して径２ｍｍ以下としたものを用いる。乾燥後、乾燥機から取り出し、重量を精密に量る。加熱した場合は、デシケーター（シリカゲル）で放冷し、重量を精密に量る。加熱温度は各条に規定する温度の±２ﾟの範囲とする。各条に規定する乾燥温度よりも低温で融解する試料は、融解温度より５ﾟ〜１０ﾟ低い温度で、１〜２時間乾燥した後、各条に規定する条件で乾燥する。乾燥剤は各条に規定するものを用い、しばしば取り替える。

(6) 吸光度測定法

　吸光度測定法は、物質が一定の狭い波長範囲の光を吸収する度合を測定する方法である。単色光がある物質の溶液を通過するとき、透過光の強さ（Ｉ）の入射光の強さ（Ｉ_０）に対する比率を透過度（ｔ）といい、これを百分率で表わしたものを透過率（Ｔ）という。また、透過度の逆数の常用対数を吸光度（Ａ）という。

　ｔ＝Ｉ／Ｉ_０　Ｔ＝（Ｉ／Ｉ_０）×１００＝１００ｔ　Ａ＝ｌｏｇ（Ｉ_０／Ｉ）

　　＝−ｌｏｇｔ＝２−ｌｏｇＴ

　物質の溶液に光を通すとき、吸光度はその光の波長によつて異なる。従つて、少しずつ波長の異なつた光について吸光度を測定し、それらの吸光度と波長との関係を示す曲線を描くと吸収スペクトルが得られる。吸収スペクトルから、その物質の吸収の極大波長（λｍａｘ）及び極小波長（λｍｉｎ）を知ることができる。

　吸収スペクトルはその物質の化学構造によつて定まるから、吸収の極大波長若しくは極小波長を測定し、又は特定の２つの波長における吸光度の比を測定することによつて確認又は純度の試験を行う。また、通例、極大波長における一定濃度の溶液の吸光度を測定することによつて、定量を行う。

　吸光度（Ａ）は溶液の濃度（ｃ）及び層長（ｌ）に比例する。Ａ＝ｋｃｌ

　ｌを１ｃｍ、ｃを１Ｗ／Ｖ％溶液に換算したときの吸光度を比吸光度（Ｅ^１％_１ｃｍ）、ｌを１ｃｍ、ｃを１モルの溶液に換算したときの吸光度をモル吸光係数（ε）という。吸収の極大波長におけるモル吸光係数は εｍａｘで表わす。

　Ｅ^１％_１ｃｍ＝Ａ／（ｃ（％）×ｌ）　ε＝Ａ／（ｃ（モル）×ｌ）

　ｌ：層長（ｃｍ）

　Ａ：吸光度

　ｃ（％）：溶液の濃度（Ｗ／Ｖ％）

　ｃ（モル）：溶液のモル濃度

装置

　測定装置として光電分光光度計を用いる。光電分光光度計は分光装置と光電光度計を備えたもので、光源としては、可視部の測定にあつてはタングステンランプを用い、紫外部の測定にあつては水素放電管又は重水素放電管を用いる。紫外部の吸収測定にあつては石英製のセルを用い、可視部の吸収測定にあつてはガラス製又は石英製のセルを用いる。なお、別に規定する場合を除き、層長は１ｃｍとする。

操作法

　通例、まず波長目盛りを規定する測定波長に合わせ、暗電流をゼロに調整した後、対照液を入れたセルを光路に入れ、シャッターを開き、吸光度がゼロを示すように調整する。対照液は別に規定する場合を除き、試験に用いた溶媒を用いる。次に測定しようとする溶液を入れたセルを光路に入れ換えて、このとき示す吸光度を読みとる。特に波長幅を規定する場合はそれによつて測定を行う。

　紫外部の吸収測定に用いる溶媒の吸収については特に考慮し、測定の妨げにならないものを用いる。

　なお、波長及び吸光度目盛の補正は次の方法による。

　波長目盛りは通例、石英水銀アーク灯若しくはガラス水銀アーク灯による２３９．９５ｎｍ、２５３．６５ｎｍ、３０２．１５ｎｍ、３１３．１６ｎｍ、３３４．１５ｎｍ、３６５．４８ｎｍ、４０４．６６ｎｍ、４３５．８３ｎｍ若しくは５４６．１０ｎｍ、水素放電管による４８６．１３ｎｍ若しくは６５６．２８ｎｍ又は重水素放電管による４８６．０２ｎｍ若しくは６５６．１０ｎｍの線を用いて補正する。

　吸光度目盛りは、重クロム酸カリウム（標準試薬）を０．００５ｍｏｌ／Ｌ硫酸に溶かして０．００６Ｗ／Ｖ％とした液を用いて補正する。この溶液のＥ^１％_１ｃｍは波長２３５ｎｍ（極小）、２５７ｎｍ（極大）、３１３ｎｍ（極小）及び３５０ｎｍ（極大）においてそれぞれ１２５．２、１４５．６、４８．９及び１０７．０である。

(7) 凝固点測定法

　凝固点とは、次の方法で操作したとき、一定になつたときの温度をいう。

装置

　図に示すものを用いる。

　図　（略）

浴液

　加熱浴液　水、グリセリン、リン酸トリクレシル、植物油、硫酸など適当なもの。

　常温で試料が固体の場合は図とは別に加熱浴そうを設ける。形状、材質等は適当なものとする。

冷却浴液　凝固点に応じて、次のものを用いる。

　８０ﾟ以上の場合：グリセリン、リン酸トリクレシル、植物油など適当なもの。

　８０〜０ﾟの場合：水又は氷

　０〜−１０ﾟの場合：砕氷及び塩化ナトリウム、又はメチルアルコール及びドライアイス

操作法

�@　試料が常温で固体の場合

　清浄にし、乾燥した試料容器Ｂに乾燥試料を溶融したときに液面が標線Ｃに一致するように入れ、予想する凝固点より２０ｄｅｇ以上高くならないように加熱浴中で注意しながら加熱し、完全に試料を溶融させた後、浴中から取り出し、図に示すように温度計Ｆ、補助温度計Ｈ及びかき混ぜ棒を挿入し、コルクせんで固定し、更に予想する凝固点よりも５ｄｅｇ低い温度の浴液を入れた冷却浴に浸す。

　かき混ぜ棒を上下に動かし、試料の温度が予想する凝固点よりも５ｄｅｇ高い温度に達したとき、かき混ぜ棒を毎分２０〜３０回の割合で穏やかに上下に動かし、３０秒ごとに温度を読む。

　温度は初めには緩やかに降下するが、結晶を生じて上昇し始めたら、かき混ぜるのをやめ、１０秒間ごとに温度を読み、１分間一定にとどまつたときの温度計Ｆの示度及び補助温度計Ｈの示度を読み取り、次式によつて凝固点を算出する。

　Ｔ＝ｔ＋０．０００１６（ｔ−ｔ′）ｎ

　　Ｔ：凝固点（℃）

　　ｔ：温度計の示度（℃）

　　ｔ′：補助温度計の示度（℃）

　　ｎ：温度計水銀線の液外にある度数（ｄｅｇ）

�A　試料が常温で液体の場合

　清浄にし、乾燥した容器Ｂに乾燥試料を標線Ｃに液面が一致するように入れ、図に示すように温度計Ｆ、補助温度計Ｈ及びかき混ぜ棒を挿入し、コルクせんで固定し、更に予想する凝固点より５〜１０ｄｅｇ低い温度の溶液を入れた冷却浴に浸す。以下固体の場合に準ずる。

(8) 強熱減量試験法

　強熱減量試験法は、試料を各条に規定する条件で強熱し、その減量を測定する方法である。この方法は、強熱することによつて、その構成成分の一部又は混在物を失う無機品目について用いる。各条に、例えば、４０．０〜５２．０％（１ｇ，４５０〜５５０ﾟ，３時間）と規定するものは、本品約１ｇを精密に量り、４５０〜５５０ﾟで３時間強熱するとき、その減量が本品１ｇにつき４００〜５２０ｍｇであることを示す。

　操作法

　あらかじめ、白金製、石英製又は磁製のるつぼ又はさらを各条に規定する温度で恒量になるまで強熱し、放冷後、その重量を精密に量る。

　試料は各条に規定する量の±１０％の範囲内で採取し、前記の容器に入れ、その重量を精密に量る。これを各条に規定する条件で強熱し、放冷後、その重量を精密に量る。放冷はデシケーター（シリカゲル）で行う。

(9) 強熱残分試験法

　強熱残分試験法は、試料を次の操作法によつて強熱するとき、揮発せずに残留する物質の量を測定する方法である。この方法は、通例、有機物中に不純物として含まれる無機物の含量を知るために用いるが、場合によつては、有機物中に構成成分として含まれる無機物又は熱時揮発する無機物中に含まれる不純物の量を測定するために用いる。

　各条に、例えば、０．１％以下（１ｇ）と規定するものは、本品約１ｇを精密に量り、次の操作法によつて強熱するとき、その残分が本品１ｇにつき１ｍｇ以下であることを示す。また、乾燥後とあるときは、乾燥減量の項の条件で乾燥した後測定する。

操作法

　あらかじめ白金製、石英製又は磁製のるつぼを４５０〜５５０ﾟで恒量になるまで強熱し、放冷後、その重量を精密に量る。試料は、各条に規定する量の±１０％の範囲内で採取し、前記の容器に入れ、その重量を精密に量る。これに硫酸少量を加えて試料を潤し、徐々に加熱してなるべく低温でほとんど灰化又は揮散した後、いつたん放冷し、さらに硫酸少量で潤して徐々に加熱し、白煙が生じなくなつた後、４５０〜５５０ﾟで強熱し、残留物を完全に灰化し、放冷後、その重量を精密に量る。放冷はデシケーター（シリカゲル）で行う。

　各条における強熱残分の規定が％以下若しくはｍｇ以下で示されていて、上記の操作によつて得た値がこの値より大きい場合又は強熱残分の規定が一定の範囲をもつて示されている場合は、恒量になるまで強熱を行う。

(10)　屈折率測定法

　物質の屈折率とは、真空中の光の速度と物質中の光の速度との比で、物質に対する光の入射角の正弦と屈折角の正弦との比に等しい。一般に屈折率は光の波長及び温度によつて変化する。

　屈折率は空気に対する値で示し、光線としてナトリウムスペクトルＤ線を用い、温度ｔﾟで測定したとき、ｎ^ｔ_Ｄで表わす。

操作法

　屈折率の測定には、通例、アッベ型屈折計を用い、各条に規定する温度の±０．２ﾟの範囲内で行う。

(11)　原子吸光光度法

　原子吸光光度法は、光が原子蒸気層を通過するとき、基底状態の原子が特有波長の光を吸収する現象を利用し、試料中の元素の濃度を測定する方法である。

装置

　通例、光源部、試料原子化部、分光部及び測光部からなる。光源部には中空陰極ランプ、放電ランプ等を用いる。試料原子化部はフレーム方式（直接噴霧法）及びフレームレス方式があり、フレームレス方式はさらに還元気化法、加熱気化法等に分けられる。フレーム方式にあつてはバーナー及びガス流量調節器、還元気化法にあつては密閉器及びポンプ、加熱気化法にあつては石英さら及び加熱装置からなる。分光部には回折格子又はプリズムを用いる。測光部は検出器、指示計器等からなる。

操作法

　別に規定する場合を除き、次のいずれかの方法による。

�@　フレーム方式

　別に規定する光源ランプを装てんし、測光部に通電する。光源ランプを点灯し、分光器を別に規定する分析線波長に合わせた後、適当な電流値に設定する。次に別に規定する支燃性ガス及び可燃性ガスを用い、これらの混合ガスに点火してガス流量、圧力を調節し、溶媒をフレーム中に噴霧してゼロ合わせを行う。別に規定する方法で調製した試料溶液をフレーム中に噴霧し、その吸光度を測定する。

�A　フレームレス方式

　別に規定する光源ランプを装てんし、測光部に通電する。光源ランプを点灯し、分光器を別に規定する分析線波長に合わせた後、適当な電流値に設定する。次に還元気化法では試料溶液を密閉器にとり、適当な還元剤を加えて元素になるまで還元した後、気化させる。また、加熱気化法では試料を加熱して気化させる。これらの方法によつて生じた原子蒸気の吸光度を測定する。

　定量は、通例、次のいずれかの方法による。なお、定量に際しては、干渉及びバックグラウンドを考慮する必要がある。

�@　検量線法

　３種以上の濃度の異なる標準溶液を調製し、それぞれの標準溶液につき、その吸光度を測定し、得られた値から検量線を作成する。次に測定可能な濃度範囲に調製した試料溶液の吸光度を測定した後、検量線から被検元素量（濃度）を求める。

�A　標準添加法

　同量の試料溶液３個以上をとり、それぞれに被検元素が段階的に含まれるように標準溶液を添加し、さらに溶媒を加えて一定容量とする。それぞれの溶液につき、吸光度を測定し、横軸に添加した標準被検元素量（濃度）、縦軸に吸光度をとり、グラフにそれぞれの値をプロットする。プロットから得られた回帰線を延長し、横軸との交点と原点との距離から被検元素量（濃度）を求める。ただし、この方法は、�@による検量線が原点をとおる直線の場合のみに適用できる。

�B　内部標準法

　内部標準元素の一定量に対し、標準被検元素の既知量をそれぞれ段階的に加え、標準溶液を調製する。それぞれの溶液につき、各元素の分析線波長で標準被検元素による吸光度及び内部標準元素による吸光度を同一条件で測定し、標準被検元素による吸光度と内部標準元素による吸光度との比を求める。横軸に標準被検元素量（濃度）、縦軸に吸光度の比をとり、検量線を作成する。次に試料溶液の調製には、あらかじめ標準溶液の場合と同量の内部標準元素を加える。次いで検量線を作成したときと同一条件で得た被検元素による吸光度と内部標準元素による吸光度との比を求め、検量線から被検元素量（濃度）を求める。

(12)　抗菌活性試験法

　抗菌活性試験法は、飼料添加物中の酵素の抗菌活性の有無を生物学的方法によつて測定する試験法である。この試験に使用する水、試薬、試液、計量器、容器及びディスクは、必要に応じ無菌のものを用いる。

試験用器具

　ディスクは、直径１０ｍｍのものを、メンブランフィルターは、孔径０．４５μｍのものを使用し、ペトリ皿は、内径９０ｍｍ、高さ２０ｍｍの硬質ガラス製又は合成樹脂製であつて、底面が平滑で、これに適合するふたを有するものを使用する。

培地の種類並びにその組成及びｐＨ

　別に規定する場合を除き、次の表に掲げる組成及びｐＨを有するものを使用する。

　培地の組成及びｐＨ

培地 1,000ｍＬ の組成	培地番号	１	２	３
	ペプトン（ｇ） 肉エキス（ｇ） 食塩（ｇ） ブドウ糖（ｇ） 膵消化カゼイン（ｇ） パパイン消化大豆（ｇ） リン酸一水素カリウム（ｇ） 寒天（ｇ） 蒸留水	１０ ５ ２．５ １３−１５ 適量	５ ２．５ １７ ３ ２．５ 適量	５ １５ ５ １３−１５ 適量
	滅菌後のｐＨ	6.5±0.1	7.3±0.1	7.3±0.1

試験菌液の調製

平板培地の調製

　３種類の試験菌液１．５ｍＬずつをとり、それぞれ一度溶かして、試験菌の活力を阻害しない温度に冷却した３号培地１３．５ｍＬに加え、完全に混和した後、滅菌ペトリ皿に注入し、水平に静置して培地を凝固させる。

操作法

　試料１ｇに水９ｍＬを加えよく振り混ぜ、毎分３，０００回転で５分間遠心分離し、その上澄液をメンブランフィルターを用いてろ過滅菌して試料溶液とする。ディスク６枚に試料溶液０．１ｍＬずつを充分に吸着させ、３種類の平板培地上に各２枚ずつ対角になるように置く。さらに、ディスク６枚に水０．１ｍＬを充分に吸着させ、２枚ずつを正方形の各頂点となるように置き、冷所で２時間放置する。次に、３５〜３７ﾟで２２〜２４時間培養し、ディスク周囲の発育阻止円の有無を観察する。

判定基準

　直径１２ｍｍ以上の明瞭な発育阻止円を認めたとき、抗菌活性を示すものとする。

(13)　抗生物質の力価試験法

　力価試験法は、飼料添加物中の抗生物質の力価を生物学的方法又は化学的方法によつて測定する試験法である。別に規定する場合を除き、次の方法で試験を行う。この試験に使用する水、試薬・試液及び計量器・用器は必要に応じ無菌のものを用いる。

円筒（カップ）

　外径７．９〜８．１ｍｍ、内径５．９〜６．１ｍｍ、高さ９．９〜１０．１ｍｍのステンレス鋼製のものを用いる。

　なお、円筒は試験に支障をきたすものであつてはならない。

培地の種類並びにその組成及びｐＨ

　別に規定する場合を除き、次の表に掲げる組成及びｐＨを有するものを使用する。ただし、培地の成分として単にペプトンと記載してある場合は、獣肉製ペプトン又はカゼイン製ペプトンのいずれを用いても差し支えない。培地のｐＨの調整は、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又は１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を用い、滅菌後のｐＨが所定のものとなるようにする。滅菌は、高圧蒸気滅菌器を用いて１２１ﾟで２０分間行う。ただし、Bacillus subtilis ＡＴＣＣ６６３３の培地は、アンモニア試液、水酸化カリウム試液又は１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を用いて調整する。なお、既製の乾燥培地は、それぞれ規定の組成によつて調製した培地と同一成分を有し、同等の試験菌の発育及び性能を示す場合には、これを使用することができる。

培地 1,000mL の組成	培地番号	１	２	３	４	５	６	７	８	９	１０	１１	１２	１３	１４	１５	１６	１７	１８	１９
	ペプトン（ｇ）	10	10	5	6	6	10	6			10	5	3.75	5	5		10	10
	獣肉製ペプトン（ｇ）																		6
	カゼインペプトン（ｇ）																		4
	肉エキス（ｇ）	5	5	3	1.5	1.5	5	1.5			10			5	3		5	5	1.5
	塩化ナトリウム（ｇ）	2.5	2.5			2.5	2.5		5	5	5		1.25	80			2.5	2.5		50
	酵母エキス（ｇ）				3	3		3					1.25			2.5			3	2.5
	ブドウ糖（ｇ）				1	1	5	1	2.5	2.5		5				1			1	10
	ポリソルベート８０（ｍＬ）									10							0.4
	膵消化カゼイン（ｇ）								17	17
	パパイン消化大豆（ｇ）								3	3
	パパイン消化肝臓（ｇ）												0.625
	リン酸二水素カリウム（ｇ）															0.45
	リン酸一水素カリウム（ｇ）								2.5	2.5						0.69
	リン酸一水素ナトリウム１２水塩（ｇ）														2
	硫酸マグネシウム（ｇ）																			50
	カンテン（ｇ）	13〜20		13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20	13〜 20
	水	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量
	滅菌後のｐＨ	6.4〜 6.6	6.9〜 7.1	7.9〜 8.1	6.4〜 6.6	7.9〜 8.1	6.4〜 6.6	7.9〜 8.1	7.2〜 7.4	7.2〜 7.4	6.4〜 6.6	6.9〜 7.1	7.2〜 7.4	7.9〜 8.1	5.9〜 6.1	5.9〜 6.1	7.9〜 8.1	5.9〜 6.1	6.4〜 6.6	5.9〜 6.1

緩衝液

　緩衝液は、次に掲げる組成及びｐＨを有するものを滅菌して使用する。

１号緩衝液（ｐＨ４．５）

　リン酸二水素カリウム１３．６１ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、水酸化カリウム試液を用いてｐＨを４．４〜４．６に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

２号緩衝液（ｐＨ６．０）

　リン酸二水素カリウム３．５ｇ及びリン酸一水素ナトリウム１２水塩３．０ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又は薄めたリン酸（１→１５）を用いてｐＨを５．９〜６．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

３号緩衝液（ｐＨ６．０）

　リン酸二水素カリウム７．０ｇ及びリン酸一水素ナトリウム１２水塩６．０ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又は薄めたリン酸（１→１５）を用いてｐＨを５．９〜６．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

４号緩衝液（ｐＨ８．０）

　リン酸一水素カリウム１６．７３ｇ及びリン酸二水素カリウム０．５２３ｇ又は無水リン酸一水素ナトリウム１３．２ｇ及びリン酸二水素カリウム０．９１ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、リン酸を用いてｐＨを７．９〜８．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

５号緩衝液（ｐＨ６．０）

　リン酸二水素カリウム８０ｇ及びリン酸一水素カリウム２０ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、水酸化カリウム溶液（１→１０）を用いてｐＨを５．９〜６．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

６号緩衝液（ｐＨ８．０）

　リン酸二水素カリウム１３．３ｇ及び塩化ナトリウム１００ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かしたものに、水酸化カリウム試液を９２ｍＬ加え、必要があれば、水酸化カリウム試液を用いてｐＨを７．９〜８．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

７号緩衝液（ｐＨ７．０）

　リン酸二水素カリウム６．４ｇ及びリン酸一水素ナトリウム１２水塩１８．９ｇに水約９００ｍＬを加えて溶かし、必要があれば、水酸化カリウム試液又はリン酸を用いてｐＨを６．９〜７．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

８号緩衝液（ｐＨ４．０）

　乳酸９．０１ｇに水約９００ｍＬを加えて溶かしたものに、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液５０ｍＬを加え、必要があれば、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又はリン酸を用いてｐＨを３．９〜４．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

９号緩衝液（ｐＨ７．５）

　２号緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液を加えて、ｐＨを７．４〜７．６に調整する。

標準品及び常用標準品

　標準品は常用標準の力価を定めるための標準として、常用標準品は抗菌性物質の力価を定めるための標準として、独立行政法人農林水産省費安全技術センターが指定する特定製造番号の抗菌性物質である。

　標準品及び常用標準品は次のとおりであり、それぞれの右欄にそのものの本質等を参考として付記する。

標準品名	標準品の本質等	常用標準品名	常用標準品の本質等
標準アビラマイシン	アビラマイシンＡ（Ｃ６１Ｈ８８Ｃｌ２Ｏ３２）	常用標準アビラマイシン	アビラマイシン
標準エフロトマイシン	エフロトマイシンＡ１（Ｃ５９Ｈ８８Ｎ２Ｏ２０）	常用標準エフロトマイシン	エフロトマイシン
標準エンラマイシン	一塩酸エンラマイシン 〔一塩酸エンラマイシンＡ：Ｃ１０７Ｈ１３８Ｃｌ２Ｎ２６Ｏ３１・ＨＣｌ（５８％）、 一塩酸エンラマイシンＢ：Ｃ１０８Ｈ１４０Ｃｌ２Ｎ２６Ｏ３１・ＨＣｌ（４２％）〕	常用標準エンラマイシン	一塩酸エンラマイシン
標準オキシテトラサイクリン	オキシテトラサイクリン（Ｃ２２Ｈ２４Ｎ２Ｏ９・２Ｈ２Ｏ）	常用標準オキシテトラサイクリン	塩酸オキシテトラサイクリン
標準クロルテトラサイクリン	塩酸クロルテトラサイクリン（Ｃ２２Ｈ２３ＣｌＮ２Ｏ８・ＨＣｌ）	常用標準クロルテトラサイクリン	塩酸クロルテトラサイクリン
標準コリスチン	硫酸コリスチンＡ（Ｃ５３Ｈ１００Ｎ１６Ｏ１３・５／２Ｈ２ＳＯ４）	常用標準コリスチン	硫酸コリスチン
標準サリノマイシン	サリノマイシンナトリウム（Ｃ４２Ｈ６９Ｏ１１Ｎａ）	常用標準サリノマイシン	サリノマイシンナトリウム
標準セデカマイシン	セデカマイシンＡ（Ｃ２７Ｈ３５ＮＯ８）	常用標準セデカマイシン	セデカマイシンＡ
標準センデュラマイシン	センデュラマイシンナトリウム（Ｃ４５Ｈ７５Ｏ１６Ｎａ）	常用標準センデュラマイシン	センデュラマイシンナトリウム
標準タイロシン	タイロシンＡ（Ｃ４６Ｈ７７ＮＯ１７）	常用標準タイロシン	タイロシンＡ
標準ナラシン	ナラシンＡ（Ｃ４３Ｈ７２Ｏ１１）	常用標準ナラシン	ナラシンＡ
標準ノシヘプタイド	ノシヘプタイド（Ｃ５１Ｈ４３Ｎ１３Ｏ１２Ｓ６）	常用標準ノシヘプタイド	ノシヘプタイド
標準バシトラシン	バシトラシンＡ（Ｃ６６Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ１６Ｓ）	常用標準バシトラシン	バシトラシン
標準バージニアマイシン	バージニアマイシン 〔バージニアマイシンＭ１：Ｃ２８Ｈ３５Ｎ３Ｏ７（９５％）、 バージニアマイシンＳ：Ｃ４３Ｈ４９Ｎ７Ｏ１０（５％）〕	常用標準バージニアマイシン	バージニアマイシン
標準ビコザマイシン	ビコザマイシン（Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ７）	常用標準ビコザマイシン	ビコザマイシン
標準フラボフォスフォリポール	フラボフォスフォリポール（Ｃ６５〜７５Ｈ１２４〜１３５Ｎ６〜７Ｏ４０〜４２Ｐ）	常用標準フラボフォスフォリポール	フラボフォスフォリポール
標準モネンシン	モネンシンナトリウム（モネンシンＡナトリウム：Ｃ３６Ｈ６１Ｏ１１Ｎａ）	常用標準モネンシン	モネンシンナトリウム
標準ラサロシド	ラサロシドナトリウム（Ｃ３４Ｈ５３Ｏ８Ｎａ）	常用標準ラサロシド	ラサロシドナトリウム

各抗菌性物質の定義

�@　アビラマイシン

　Streptomyces viridochromogenes の培養によつて得られるアビラマイシンＡ（Ｃ_６１Ｈ_８８Ｃｌ_２Ｏ_３２）及びアビラマイシンＢ（Ｃ_５９Ｈ_８４Ｃｌ_２Ｏ_３２）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�A　エフロトマイシン

　Nocardia lactamdurans の培養によつて得られるエフロトマイシンＡ_１（Ｃ_５９Ｈ_８８Ｎ_２Ｏ_２０）、エフロトマイシンＡ_Ｚ（Ｃ_５９Ｈ_８８Ｎ_２Ｏ_２０）及びエフロトマイシンＢ（Ｃ_５９Ｈ_８８Ｎ_２Ｏ_２０）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�B　エンラマイシン

　Streptomyces fungicidicus の培養によつて得られるエンラマイシンＡ（Ｃ_１０７Ｈ_１３８Ｃｌ_２Ｎ_２６Ｏ_３１）及びエンラマイシンＢ（Ｃ_１０８Ｈ_１４０Ｃｌ_２Ｎ_２６Ｏ_３１）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�C　オキシテトラサイクリン

　Streptomyces rimosus の培養によつて得られるオキシテトラサイクリン（Ｃ_２２Ｈ_２４Ｎ_２Ｏ_９）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�D　クロルテトラサイクリン

　Streptomyces aureofaciens の培養によつて得られるクロルテトラサイクリン（Ｃ_２２Ｈ_２３ＣｌＮ_２Ｏ_８）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�E　コリスチン

　Bacillus polymyxa var. colistinus の培養によつて得られるコリスチンＡ（Ｃ_５３Ｈ_１００Ｎ_１６Ｏ_１３）及びコリスチンＢ（Ｃ_５２Ｈ_９８Ｎ_１６Ｏ_１３）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�F　サリノマイシン

　Streptomyces albus の培養によつて得られるサリノマイシン（Ｃ_４２Ｈ_７０Ｏ_１１）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�G　セデカマイシン

　Streptomyces rochei var. volubilis の培養によつて得られる抗生物質の誘導体であるセデカマイシンＡ（Ｃ_２７Ｈ_３５ＮＯ_８）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�H　センデュラマイシン

　Actinomadura roseorufa の培養によつて得られるセンデュラマイシン（Ｃ_４５Ｈ_７６Ｏ_１６）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�I　タイロシン

　Streptomyces fradiae の培養によつて得られるタイロシンＡ（Ｃ_４６Ｈ_７７ＮＯ_１７）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�J　ナラシン

　Streptomyces aureofaciens の培養によつて得られるナラシンＡ（Ｃ_４３Ｈ_７２Ｏ_１１）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�K　ノシヘプタイド

　Streptomyces actuosus の培養によつて得られるノシヘプタイド（Ｃ_５１Ｈ_４３Ｏ_１２Ｎ_１３Ｓ_６）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�L　バシトラシン

　Bacillus subtilis var. Tracy の培養によつて得られるバシトラシンＡ（Ｃ_６６Ｈ_１０３Ｎ_１７Ｏ_１６Ｓ）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�M　バージニアマイシン

　Streptomyces virginiae の培養によつて得られるバージニアマイシンＭ_１（Ｃ_２８Ｈ_３５Ｎ_３Ｏ_７）及びバージニアマイシンＳ（Ｃ_４３Ｈ_４９Ｎ_７Ｏ_１０）から成るもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�N　ビコザマイシン

�O　フラボフォスフォリポール

　Streptomyces bambergiensis の培養によつて得られるフラボフォスフォリポール（Ｃ_{６５〜７５}Ｈ_{１２４〜１３５}Ｎ_６〜７Ｏ_{４０〜４２}Ｐ）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�P　モネンシン

　Streptomyces cinnamonensis の培養によつて得られるモネンシンＡ（Ｃ_３６Ｈ_６２Ｏ_１１）を主成分とするもの又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

�Q　ラサロシド

　Streptomyces lasaliensis の培養によつて得られるラサロシド（Ｃ_３４Ｈ_５４Ｏ_８）又はその他の方法によつて得られるこれと同一の物質をいう。

各抗菌性物質の力価の定義

�@　アビラマイシン

　アビラマイシンの力価は、アビラマイシンＡ（Ｃ_６１Ｈ_８８Ｃｌ_２Ｏ_３２）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準アビラマイシン１μｇに対応する。

�A　エフロトマイシン

　エフロトマイシンの力価は、エフロトマイシンＡ_１（Ｃ_５９Ｈ_８８Ｎ_２Ｏ_２０）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準エフロトマイシン１μｇに対応する。

�B　エンラマイシン

　エンラマイシンの力価は、一塩酸エンラマイシン〔一塩酸エンラマイシンＡ（Ｃ_１０７Ｈ_１３８Ｃｌ_２Ｎ_２６Ｏ_３１・ＨＣｌ）５８％、一塩酸エンラマイシンＢ（Ｃ_１０８Ｈ_１４０Ｃｌ_２Ｎ_２６Ｏ_３１・ＨＣｌ）４２％〕としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．１３ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、４時間乾燥した標準エンラマイシン１μｇに対応する。

�C　オキシテトラサイクリン

　オキシテトラサイクリンの力価は、オキシテトラサイクリン（Ｃ_２２Ｈ_２４Ｎ_２Ｏ_９）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準オキシテトラサイクリン１．０８２μｇに対応する。

�D　クロルテトラサイクリン

　クロルテトラサイクリンの力価は、塩酸クロルテトラサイクリン（Ｃ_２２Ｈ_２３ＣｌＮ_２Ｏ_８・ＨＣｌ）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準クロルテトラサイクリン１μｇに対応する。

�E　コリスチン

　コリスチンの力価は、コリスチンＡ（Ｃ_５３Ｈ_１００Ｎ_１６Ｏ_１３）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準コリスチン１．２１μｇに対応する。（１μｇ（力価）は、３０単位とする。）

�F　サリノマイシン

　サリノマイシンの力価は、サリノマイシンナトリウム（Ｃ_４２Ｈ_６９Ｏ_１１Ｎａ）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準サリノマイシン１μｇに対応する。

�G　セデカマイシン

　セデカマイシンの力価は、セデカマイシンＡ（Ｃ_２７Ｈ_３５ＮＯ_８）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準セデカマイシン１μｇに対応する。

�H　センデュラマイシン

　センデュラマイシンの力価は、センデュラマイシン（Ｃ_４５Ｈ_７６Ｏ_１６Ｎａ）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、１００ﾟ、３時間乾燥した標準センデュラマイシン１μｇに対応する。

�I　タイロシン

　タイロシンの力価は、タイロシンＡ（Ｃ_４６Ｈ_７７ＮＯ_１７）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準タイロシン１μｇに対応する。

�J　ナラシン

　ナラシンの力価は、ナラシンＡ（Ｃ_４３Ｈ_７２Ｏ_１１）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準ナラシン１μｇに対応する。

�K　ノシヘプタイド

　ノシヘプタイドの力価は、ノシヘプタイド（Ｃ_５１Ｈ_４３Ｏ_１２Ｎ_１３Ｓ_６）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準ノシヘプタイド１μｇに対応する。

�L　バシトラシン

　バシトラシンの力価は、バシトラシンＡ（Ｃ_６６Ｈ_１０３Ｎ_１７Ｏ_１６Ｓ）としての量を単位で示す。１単位は、０．６７ｋＰａ以下の減圧下で、６０ﾟ、３時間乾燥した標準バシトラシン２３．８μｇに対応する。

�M　バージニアマイシン

　バージニアマイシンの力価は、バージニアマイシン〔バージニアマイシンＭ_１（Ｃ_２８Ｈ_３５Ｎ_３Ｏ_７）９５％、バージニアマイシンＳ（Ｃ_４３Ｈ_４９Ｎ_７Ｏ_１０）５％〕としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準バージニアマイシン１μｇに対応する。

�N　ビコザマイシン

　ビコザマイシンの力価は、ビコザマイシン（Ｃ_１２Ｈ_１８Ｎ_２Ｏ_７）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準ビコザマイシン１μｇに対応する。

�O　フラボフォスフォリポール

　フラボフォスフォリポールの力価は、フラボフォスフォリポール（Ｃ_{６５〜７５}Ｈ_{１２４〜１３５}Ｎ_６〜７Ｏ_{４０〜４２}Ｐ）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準フラボフォスフォリポール１μｇに対応する。

�P　モネンシン

　モネンシンの力価は、モネンシンＡ（Ｃ_３６Ｈ_６２Ｏ_１１）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準モネンシン１．０６４μｇに対応する。

�Q　ラサロシド

　ラサロシドの力価は、ラサロシドナトリウム（Ｃ_３４Ｈ_５３Ｏ_８Ｎａ）としての量を重量（力価）で示す。１μｇ（力価）は、標準ラサロシド１μｇに対応する。

菌液又は胞子液の調製

　試験菌としてMicrococcus luteus ATCC 9341 、Micrococcus luteus ATCC 10240、Escherichia coli ATCC 27166、Bordetella bronchiseptica ATCC 4617、Corynebacterium xerosis NCTC 9755、Bacillus subtilis ATCC 6633、Bacillus brevis ATCC 8185 又はBacillus cereus ATCC 19637 を用いるときは、別に規定する場合を除き、次の方法で菌液又は胞子液を調製する。

　１８号培地に約１週間隔で移植を繰り返し、３２〜３７ﾟで培養しながら継代保存した試験菌を、使用に当たつて２号培地に接種し、３２〜３７ﾟで１６〜２４時間培養し、菌液とする。あるいは、継代培養した試験菌を１８号培地約９ｍＬを入れた試験管斜面寒天培地（内径１６ｍｍ）に接種し、３２〜３７ﾟで１６〜２４時間培養した後、この試験管斜面寒天培地に生理食塩液１０ｍＬを加え、発育した菌を洗い落として他の試験管に移し、菌液とする。菌液は、５ﾟ以下に保存し、Micrococcus luteus ATCC 9341にあつては５日以内に、その他の菌にあつては７日以内に使用する。

�A　Corynebacterium xerosis NCTC 9755 の菌液の調製

　１号培地に３５〜３７ﾟで１６〜２４時間３回継代培養する。これを２号培地に移植し、３５〜３７ﾟで３〜４時間振とう培養（振幅５ｃｍ、振動数１１０往復／１分）し、菌液とする。菌液は、用時製する。

　１号培地に約３か月間隔で移植を繰り返し、３２〜３７ﾟで培養しながら継代保存した試験菌をルー瓶に入れた同培地に接種し、３２〜３７ﾟで１週間以上培養して胞子を作らせる。

　この胞子を生理食塩液１００ｍＬに浮遊して、６５ﾟで３０分間加熱する。遠心分離を行い、胞子を採り、更に生理食塩液約５０ｍＬずつで３回遠心分離して洗つた後、生理食塩液１００ｍＬに浮遊して、６５ﾟで３０分間加熱し、胞子液とする。胞子液は、５ﾟ以下に保存し、６か月以内に使用する。

�C　Bacillus cereus ATCC 19637 の胞子液の調製

　１号培地に約２週間隔で移植を繰り返し、２７〜２９ﾟで培養しながら継代保存した試験菌をルー瓶に入れた同培地に接種し、２７〜２９ﾟで１週間以上培養して胞子を作らせた後、室温（約２５ﾟ）に約１週間放置する。この胞子を生理食塩液１００ｍＬに浮遊して、６５ﾟで３０分間加熱する。遠心分離を行い、胞子を採り、更に生理食塩液５０ｍＬずつで３回遠心分離して洗つた後、生理食塩液１００ｍＬに浮遊して、６５ﾟで３０分間加熱し、胞子液とする。胞子液は、５ﾟ以下に保存し、６か月以内に使用する。

円筒寒天平板の調製

　別に規定する場合を除き、内径約９０ｍｍのペトリ皿を用いる場合は基層用培地２０ｍＬを、内径約１００ｍｍのペトリ皿を用いる場合は同培地２１ｍＬを、また、大型皿を用いる場合は培地の厚さが２〜３ｍｍとなるように同培地を分注し、培地を平らにゆきわたらせ、水平に静置して固化させ、基層とする。一度溶かして試験菌の活力を阻害しない温度に冷却した各条に規定する種層用培地に、菌液又は胞子液を加え、十分に混和した後、ペトリ皿においては４ｍＬを、大型皿においてはその厚さが１．５〜２．５ｍｍとなるように固めた基層上に分注し、基層の上面に一様に広がるように操作した後、水平に静置して培地を固化させ平板とする。４個の円筒（カップ）を平板上に（内径約９０ｍｍのペトリ皿の場合には半径約２５ｍｍ、内径約１００ｍｍのペトリ皿の場合には半径約２８ｍｍの円周上に）、隣り合う各々が中心に対して約９０ﾟとなるように置き、円筒寒天平板を作る。また、大型皿平板を用いる場合は、ペトリ皿平板に準ずる配置に円筒（カップ）を置き、４個１組でペトリ皿１枚分とする。平板上に円筒（カップ）を置く際には、円筒（カップ）を１０〜１３ｍｍの高さから垂直に落とす。種層用培地に添加する菌液又は胞子液の量は、円筒寒天平板を培養したとき、高濃度の常用標準希釈液による阻止円の直径が２０〜２５ｍｍに、低濃度の常用標準希釈液による阻止円の直径が１５〜２０ｍｍになるように調整する。

　なお、円筒寒天平板の代わりに、平板に平板器底に達する直径７．９〜８．１ｍｍの円形のせん孔を施したせん孔寒天平板を用いることができる。

常用標準希釈液の調製

　常用標準希釈液は、常用標準品適量を量りとり、各条の規定に従い調製した希釈原液を使用に当たつて高低２種類の規定濃度に希釈した液である（以下、高濃度の希釈液を「Ｓ_Ｈ」、低濃度の希釈液を「Ｓ_Ｌ」という。）。

　なお、常用標準品を量りとる場合には、別に規定する場合を除き、相対湿度５０％以下の大気中で量り、化学はかりを用いる場合の秤取量は、次の表の常用標準品の秤取量の欄に掲げる量とし、同表の常用標準品の予備乾燥条件の欄に乾燥条件が記載されている場合にあつては、当該条件であらかじめ乾燥した後、規定量を量りとる。

　また、希釈原液は、原則としてそれぞれ次の表の希釈原液の保存温度の欄に掲げる温度で保存して有効期間内に使用するものとし、常用標準希釈液は、用時製する。

常用標準品名	常用標準品の秤取量	常用標準品の予備乾燥条件	希釈原液の保存温度	希釈原液の有効期間
常用標準アビラマイシン	約２０ｍｇ（力価）相当量以上	2.67〜3.33kPa，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	３０日
常用標準エフロトマイシン	約１２ｍｇ以上	−	５ﾟ以下	５日
常用標準エンラマイシン	約２０ｍｇ以上	0.27kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	７日
常用標準オキシテトラサイクリン	約２５ｍｇ（力価）相当量以上	−	５ﾟ以下	７日
常用標準クロルテトラサイクリン	約２５ｍｇ（力価）相当量以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	２日
常用標準コリスチン	約３０ｍｇ以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	１０ﾟ以下	７日
常用標準サリノマイシン	約２０ｍｇ（力価）相当量以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	１４日
常用標準セデカマイシン	約２５ｍｇ（力価）相当量以上	−	５ﾟ以下	２日
常用標準センデュラマイシン	約２５ｍｇ（力価）相当量以上	0.67kPa以下，１００ﾟ，３時間	５ﾟ以下	７日
常用標準タイロシン	約２０ｍｇ（力価）相当量以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	７日
常用標準ナラシン	約２５ｍｇ（力価）相当量以上	−	５ﾟ以下	１４日
常用標準ノシヘプタイド	約２０ｍｇ以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	１４日
常用標準バシトラシン	約３０ｍｇ以上	0.67kPa以下，６０ﾟ，３時間	５ﾟ以下	２日
常用標準バージニアマイシン	約２０ｍｇ（力価）相当量以上	−	１０ﾟ以下	７日
常用標準ビゴザマイシン	約２０ｍｇ以上	−	５ﾟ以下	４日
常用標準フラボフォスフォリポール	約２０ｍｇ以上	−	１０ﾟ以下	１４日
常用標準モネンシン	約２０ｍｇ（力価）相当量以上	−	５ﾟ以下	１４日
常用標準ラサロシド	約２０ｍｇ以上	−	５ﾟ以下	３０日

試料液の調製

　各条で規定する（以下高濃度の試料液を「Ｕ_Ｈ」、低濃度の試料液を「Ｕ_Ｌ」という。）。

　なお、調製された試料原液又は試料液は、調製日の翌日以降において、試験の用に供してはならない。

操作法

　円筒寒天平板５枚（大型皿円筒寒天平板を用いる場合はこれに準ずる配置区分）を使用する。次の図に示す各円筒寒天平板の第１の円筒にはＳＨを、第２の円筒にはＵＨを、第３の円筒にはＳＬを、第４の円筒にはＵＬをそれぞれ満たし、注意してこれをふ卵器に収め、Bacillus cereus にあつては２７〜２９ﾟ、その他の菌にあつては３２〜３７ﾟで１６〜２０時間培養する。培養後、各阻止円の直径を少なくとも０．２５ｍｍの精度で測定する。必要があれば、測定した阻止円の直径を次の表に例示する様式のカードに記入する。

　なお、せん孔寒天平板の各孔に注入する常用標準希釈液及び試料液は、各一定量ずつで満たす。

　図　（略）

円筒番号	１	２	３	４
円筒内容	高濃度常用標準希釈液 ＳＨ	低濃度常用標準希釈液 ＳＬ	高濃度試料液 ＵＨ	低濃度試料液 ＵＬ
寒天平板
�T �U �V �W �X	ｍｍ	ｍｍ	ｍｍ	ｍｍ
計	ΣＳＨ	ΣＳＬ	ΣＵＨ	ΣＵＬ

力価計算

　円筒内の液体の力価（Ｐ）と阻止円の直径（ｄ）との間には次の関係が成立している。

　　ｄ＝αｌｏｇＰ＋β（α及びβは定数）

　必要に応じて、この関係式を確かめ、採取した試料中の力価を次の式により求める。

　採取した試験品の力価＝Ａ×高濃度常用標準希釈液１ｍＬ中の力価×高濃度試料液の希釈倍率

　ただし、

　　ｌｏｇＡ＝（Ｉ×Ｖ）／Ｗ

　　Ｉ=ｌｏｇ（Ｓ_Ｈの力価／Ｓ_Ｌの力価）

　　Ｖ=ΣＵ_Ｈ+ΣＵ_Ｌ−ΣＳ_Ｈ−ΣＳ_Ｌ

　　Ｗ=ΣＵ_Ｈ+ΣＳ_Ｈ−ΣＵ_Ｌ−ΣＳ_Ｌ

　Ｓ_Ｈ、Ｓ_Ｌ、Ｕ_Ｈ及びＵ_Ｌの各円筒平板の阻止円直径（ｍｍ）の和をそれぞれΣＳ_Ｈ、ΣＳ_Ｌ、ΣＵ_Ｈ及びΣＵ_Ｌとする。

(14)　酵素力試験法

�@　キシラン糖化力試験法

　キシラン糖化力試験法は、キシランにキシラナーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する還元力により、飼料添加物中のキシラナーゼの量を測定する方法であり、その単位は、キシラン糖化力単位で示す。

　１キシラン糖化力単位は、キシラナーゼがキシランに４０゜で作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルのキシロースに相当する還元力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　キシラン４．０ｇを正確に量り、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液５０ｍＬに徐々に加えながら激しく振り混ぜて溶かし、フェノールフタレイン試液２滴を加え、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液で中和した後、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液１００ｍＬを加え、更に水を加えて、正確に２００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が０．１から０．２キシラン糖化力単位となるように、水又は試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．０１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、時々かき混ぜながら１時間放置した後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。基質溶液２ｍＬを正確に量り、２５×２００ｍｍの試験管に入れ、４０±０．２゜の水浴中に５分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、直ちに４０±０．２゜の水浴中で正確に３０分間放置する。次に、薄めた硫酸（６→１００）０．５ｍＬを加えてよく振り混ぜ、１０分間放置した後、フェノールフタレイン試液１滴を加え、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液で中和する。更に水を加えて５ｍＬとし、アルカリ性銅試液Ａ５ｍＬを正確に加え、試験管の口をアルミホイルで軽く覆い、時々振り混ぜながら２０分間水浴中で加熱した後、２０から３０゜に冷却する。冷後、ヨウ化カリウム溶液（１→４０）２ｍＬを加え、更に薄めた硫酸（６→１００）１．５ｍＬを加え、直ちに激しく振り混ぜる。液が澄明になつた後、０．００５ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム液で滴定する（指示薬　デンプン試液１ｍＬ）。この場合において、滴定の終点は、液の青色が消えたときとし、その滴定量をＡｍＬとする。

　別に基質溶液２ｍＬを正確に量り、２５×２００ｍｍの試験管に入れ、薄めた硫酸（６→１００）０．５ｍＬを加えてよく振り混ぜた後、試料溶液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜる。次に、フェノールフタレイン試液１滴を加え、以下同様の方法で操作し、その滴定量をＢｍＬとする。０．００５ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム液の消費量の差（Ｂ−Ａ）（ｍＬ）に対応するキシロースの量（ｇ）を検量線から求め、Ｋとする。

　１ｇ中のキシラン糖化力単位＝（Ｋ／（１５０．１３×１０^−６×３０））×（１／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

検量線の作成

　キシロースを１０５ﾟで３時間乾燥し、その０．５０ｇを正確に量り、水を加えて溶かし、正確に１００ｍＬとする。この液１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ及び４ｍＬを正確に量り、それぞれに水を加えて正確に１００ｍＬとする。それぞれの液５ｍＬを正確に量り、それぞれ２５×２００ｍｍの試験管に入れ、アルカリ性銅試液Ａ５ｍＬを正確に加え、以下試料と同様の方法で操作し、その滴定量をそれぞれＳ_１ｍＬ、Ｓ_２ｍＬ、Ｓ_３ｍＬ及びＳ_４ｍＬとする。別に水５ｍＬを正確に量り、２５×２００ｍｍの試験管に入れ、アルカリ性銅試液Ａ５ｍＬを正確に加え、以下試料と同様の方法で操作し、その滴定量をＢ′ｍＬとする。０．００５ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム液の消費量の差（Ｂ′−Ｓ_１）、（Ｂ′−Ｓ_２）、（Ｂ′−Ｓ_３）及び（Ｂ′−Ｓ_４）を縦軸に、それぞれに対応するキシロースの量（ｇ）を横軸にとり、検量線を作成する。

�A　β−グルカン糖化力試験法

　β−グルカン糖化力試験法は、β−グルカンにβ−グルカナーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する還元力により、飼料添加物中のβ−グルカナーゼの量を測定する方法であり、その単位は、β−グルカン糖化力単位で示す。

　１β−グルカン糖化力単位は、β−グルカナーゼがβ−グルカンに３０ﾟで作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルのブドウ糖に相当する還元力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　β−グルカン１．０ｇを正確に量り、１０ｍＬのエタノールで湿らせた後、約８０ｍＬの水を加えて沸騰させ、β−グルカンを溶解する。かき混ぜながら室温に戻し水を加えて正確に１００ｍＬとし、ガラスろ過器（Ｇ３）でろ過する。冷蔵庫中で保存し２日以内に使用する。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が０．１から０．２β−グルカン糖化力単位となるように、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、１時間かき混ぜた後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。基質溶液１ｍＬを正確に量り、１６×２００ｍｍの試験管に入れ、３０±０．２ﾟの水浴中に５分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、直ちに３０±０．２ﾟの水浴中で正確に１０分間放置する。次にジニトロサリチル酸試液３ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、試験管の口をアルミホイルで軽く覆い、正確に５分間煮沸した後、冷水浴中で冷却し、室温に戻す。この液につき、波長５４０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。

　別に基質溶液１ｍＬを正確に量り、１６×２００ｍｍの試験管に入れ、ジニトロサリチル酸試液３ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜた後、試料溶液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、直ちに３０±０．２ﾟの水浴中に正確に１０分間放置する。以下同様の方法で操作し、吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。

　１ｇ中のβ−グルカン糖化力単位＝（（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｔ′）／（１０×０．１８））×（１／Ｗ）×Ｆ

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対するブドウ糖の量（ｍｇ）

検量線の作成

　あらかじめブドウ糖約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで６時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物１ｇに対応するブドウ糖を正確に量り、水を加えて溶かし、正確に１００ｍＬとする。この液１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ及び６ｍＬを正確に量り、それぞれに水を加えて正確に１００ｍＬとする。それぞれの液１ｍＬ及び水１ｍＬを正確に量り、１６×２００ｍｍの試験管に入れ、ジニトロサリチル酸試液３ｍＬをそれぞれ正確に加えてよく振り混ぜ、試験管の口をアルミホイルで軽く覆い、正確に５分間煮沸した後、冷水浴中で冷却し、室温に戻す。これらの液につき、波長５４０ｎｍにおける吸光度Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_４、Ａ_５及びＡ_６を測定する。別に水２ｍＬを正確に量り、１６×２００ｍｍの試験管に入れ、ジニトロサリチル酸試液を３ｍＬ正確に加え、以下同様の方法で操作して吸光度Ａ_０を測定する。吸光度差（Ａ_１−Ａ_０）、（Ａ_２−Ａ_０）、（Ａ_３−Ａ_０）、（Ａ_４−Ａ_０）、（Ａ_５−Ａ_０）及び（Ａ_６−Ａ_０）を縦軸に、ブドウ糖の量（ｍｇ）を横軸にとり、検量線を作成する。

�B　脂肪消化力試験法

　脂肪消化力試験法は、オリブ油にリパーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する脂肪酸の量により、飼料添加物中のリパーゼの量を測定する方法であり、その単位は、脂肪消化力単位で示す。

　１脂肪消化力単位は、リパーゼがオリブ油に作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルの脂肪酸に相当する消化力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　ポリビニルアルコール試液・オリブ油混液（３：１）２００から３００ｍＬをとり、乳化機の５００ｍＬ容器に入れ、１０゜以下に冷却しながら、毎分１２，０００から１６，０００回転で１０分間乳化し、冷所で１時間放置した後、油層が分離しないことを確認した後使用する。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が１．０から５．０脂肪消化力単位となるように冷水を加えて溶かし、試料溶液とする。必要があれば、ろ過又は遠心分離を行う。基質溶液５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液４ｍＬを正確に量り、よく混合し、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加え、直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に２０分間放置する。次に、アセトン・エタノール混液（１：１）１０ｍＬを加えて振り混ぜ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液１０ｍＬを正確に加え、更にアセトン・エタノール混液（１：１）１０ｍＬを正確に加えて振り混ぜた後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ塩酸で滴定する（指示薬　フェノールフタレイン試液２から３滴）。この場合において、滴定の終点は、液の赤色が消えたときとし、その滴定量をＡｍＬとする。別に基質溶液５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液４ｍＬを正確に量り、よく混合し、３７±０．５゜で３０分間放置する。次に、アセトン・エタノール混液（１：１）１０ｍＬを正確に加えて振り混ぜ、更に試料溶液１ｍＬを正確に加えて振り混ぜ、以下同様の方法で操作し、その滴定量をＢｍＬとする。

　１ｇ中の脂肪消化力単位＝５０×（Ｂ−Ａ）×（１／２０）×（１ ／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

�C　繊維糖化力試験法

　繊維糖化力試験法は、カルボキシメチルセルロースナトリウムにセルラーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する還元力により、飼料添加物中のセルラーゼの量を測定する方法であり、その単位は、繊維糖化力単位で示す。

　１繊維糖化力単位は、セルラーゼがカルボキシメチルセルロースナトリウムに３７゜で作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルのブドウ糖に相当する還元力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　あらかじめカルボキシメチルセルロースナトリウム約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで４時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物０．６２５ｇに対応するカルボキシメチルセルロースナトリウムを正確に量り、水５０ｍＬにかき混ぜながら少量ずつ加えた後、６０から７０゜で時々かき混ぜながら２０分間加温して溶かし、冷後、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍＬを加え、更に水を加えて正確に１００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が、０．０２から０．０８繊維糖化力単位となるように水又は試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、時々かき混ぜながら１時間放置した後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。基質溶液４ｍＬを正確に量り、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に量つて加え、直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に３０分間放置する。次に、アルカリ性銅試液Ｂ２ｍＬを加えて振り混ぜ、メスフラスコに栓をし、水浴中で３０分間加熱し、水冷する。さらに、ヒ素モリブデン酸試液２ｍＬを加えてよく振り混ぜ、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液３ｍＬを加え、振り混ぜて沈殿を溶かし、２０分間放置した後、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加え正確に２５ｍＬとする。この液１ｍＬを正確に量り、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液９ｍＬを加え、よく振り混ぜ、波長７５０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。別に試料溶液１ｍＬを正確に量り、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、アルカリ性銅試液Ｂ２ｍＬを加えて振り混ぜ、基質溶液４ｍＬを正確に量つて加え、振り混ぜ、メスフラスコに栓をし、水浴中で３０分間加熱し、水冷する。以下同様の方法で操作し、吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。Ａ_Ｔ及びＡ_Ｔ′に対応するブドウ糖の量（ｍｇ）を検量線から求め、それぞれＧ_Ｔ及びＧ_Ｔ′とする。

　１ｇ中の繊維糖化力単位＝（（Ｇ_Ｔ−Ｇ_Ｔ′）／３０）×（１／０．１８）×（１／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

検量線の作成

　あらかじめブドウ糖約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで６時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物１ｇに対応するブドウ糖を正確に量り、水を加えて溶かし、正確に１，０００ｍＬとする。この液１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ及び５ｍＬを正確に量り、それぞれに水を加えて正確に１０ｍＬとする。それぞれの液１ｍＬ、基質溶液４ｍＬ及びアルカリ性銅試液Ｂ２ｍＬを正確に量り、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、振り混ぜ、メスフラスコに栓をし、水浴中で３０分間加熱し、水冷後、ヒ素モリブデン酸試液２ｍＬを加えてよく振り混ぜ、更に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液３ｍＬを加え、振り混ぜて沈殿を溶かし、２０分間放置した後、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加え、それぞれ正確に２５ｍＬとする。これらの液１ｍＬを正確に量り、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液９ｍＬを加え、よく振り混ぜる。これらの液につき、波長７５０ｎｍにおける吸光度Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３、Ａ_４及びＡ_５を測定する。別に水１ｍＬ、基質溶液４ｍＬ及びアルカリ性銅試液Ｂ２ｍＬを正確に量り、以下同様の方法で操作して、吸光度Ａ_０を測定する。吸光度差（Ａ_１−Ａ_０）、（Ａ_２−Ａ_０）、（Ａ_３−Ａ_０）、（Ａ_４−Ａ_０）及び（Ａ_５−Ａ_０）を縦軸に、ブドウ糖の量（ｍｇ）を横軸にとり、検量線を作成する。

�D　繊維崩壊力試験法

　繊維崩壊力試験法は、ろ紙にセルラーゼが作用するときに、ろ紙が崩壊する時間により、飼料添加物中のセルラーゼの量を測定する方法であり、その単位は、繊維崩壊力単位で示す。

　１，０００繊維崩壊力単位は、セルラーゼがろ紙に３７゜で作用するとき、１分間に１ｃｍ×１ｃｍの大きさの酵素定量用ろ紙２枚を完全に崩壊する酵素量に相当する。

基質の調製

　酵素定量用ろ紙（紙厚０．２９から０．３１ｍｍ、重量１２５から１３５ｇ／ｍ２、α繊維含量９８．５％以上、灰分量０．０５％以下、ろ水時間５０から９０秒／１００ｍＬ、破裂強度１．２から１．８ｋｇ／ｃｍ２、吸水高度８から９ｃｍ／１０分、透気度３０から４０秒／ｃｍ^２／１００ｍＬのものをいう。）を、光源を通して観察し、すきむらがなく、厚さが均一で異物のない個所を１ｃｍ×１ｃｍの大きさに切る。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が２．８から４．０繊維崩壊力単位となるように、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、時々かき混ぜながら１時間放置した後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。試料溶液５ｍＬずつを正確に量り、５本のＬ字型試験管に入れ、３７±０．５゜で５分間放置した後、それぞれに基質を２枚ずつ入れ、毎分６５回転、振幅６０ｍｍ及び温度３７±０．５゜で直ちに振とうする。適時、ろ紙の崩壊状態を観察し、ろ紙が完全に崩壊して微細な繊維となるまでの時間（分）を測定する。

　１ｇ中の繊維崩壊力単位＝（１／（Ｔ×Ｗ））×１，０００

　Ｔ：ろ紙が完全に崩壊するまでの時間（最短と最長のものを除く。）の平均時間（分）

　Ｗ：試料溶液５ｍＬ中の試料の量（ｇ）

Ｌ字型試験管

　図　（略）

�E　たん白消化力試験法

　たん白消化力試験法は、カゼインにプロテアーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する酸可溶性分解産物の量により、飼料添加物中のプロテアーゼの量を測定する方法であり、その単位は、たん白消化力単位で示す。

　１たん白消化力単位は、プロテアーゼが乳製カゼインに３７゜で作用するとき、反応初期の１分間に１μｇのチロシンに相当する非たん白性のフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量に相当する。

(�@) 第１法

基質溶液の調製

　あらかじめ乳製カゼイン約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで２時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物１．２０ｇに対応する乳製カゼインを正確に量り、０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸一水素ナトリウム試液１６０ｍＬを加え、水浴中で加温して溶かす。この液を流水で冷却した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液又は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液を加えて試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した後、水を加えて、正確に２００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が１０から３０たん白消化力単位となるように水又は０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。必要ならば、ろ過又は遠心分離を行う。基質溶液５ｍＬを正確に量り、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加え直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に１０分間放置する。次に、トリクロル酢酸試液Ｂ５ｍＬを加えて振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置する。さらに、この液をろ過して沈殿物を完全に除去した後、ろ液２ｍＬを正確に量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及び薄めたフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えてよく振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置した後、この液につき、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。別に試料溶液１ｍＬを正確に量り、トリクロル酢酸試液Ｂ５ｍＬを加えて振り混ぜ、基質溶液５ｍＬを正確に加え、３７±０．５゜で３０分間放置する。以下同様の方法で操作して、吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。

　１ｇ中のたん白消化力単位＝（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｔ′）×Ｆ×（１１／２）×（１／１０）×（１／Ｗ）

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対応するチロシンの量（μｇ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

検量線の作成

　チロシン標準品を１０５ﾟで３時間乾燥し、その０．５００ｇを正確に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加えて溶かし、正確に５００ｍＬとする。この液１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ及び４ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加えて正確に１００ｍＬとする。それぞれの液２ｍＬを正確に量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及び薄めたフォリン試液（１→３）１ｍＬをそれぞれ加え、３７±０．５゜で３０分間放置した後、これらの液につき、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３及びＡ_４を測定する。別に０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液２ｍＬを正確に量り、以下同様の方法で操作して、吸光度Ａ_０を測定する。吸光度差（Ａ_１−Ａ_０）、（Ａ_２−Ａ_０）、（Ａ_３−Ａ_０）及び（Ａ_４−Ａ_０）を縦軸に、チロシンの量（μｇ）を横軸にとり、検量線を作成する。

(�A) 第２法

基質溶液の調製

　あらかじめ乳製カゼイン約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで２時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物１．２０ｇに対応する乳製カゼインを正確に量り、１ｍｏｌ／Ｌ乳酸試液１６ｍＬ及び水１４６ｍＬを加え、水浴中で加温して溶かす。この液を流水で冷却した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液又は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液を加えて試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した後、水を加えて、正確に２００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が１０から３０たん白消化力単位となるように水、０．１ｍｏｌ／Ｌ乳酸塩緩衝液、酢酸塩酸緩衝液又は０．０１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。必要ならば、ろ過又は遠心分離を行う。基質溶液５ｍＬを正確に量り、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加え直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に１０分間放置する。次に、トリクロル酢酸試液Ａ５ｍＬを加えて振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置する。さらに、この液をろ過して沈殿物を完全に除去した後、ろ液２ｍＬを正確に量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及び薄めたフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えてよく振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置した後、この液につき、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。別に試料溶液１ｍＬを正確に量り、トリクロル酢酸試液Ａ５ｍＬを加えて振り混ぜ、基質溶液５ｍＬを正確に加え、３７±０．５゜で３０分間放置する。以下同様の方法で操作して、吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。

　１ｇ中のたん白消化力単位＝（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｔ′）×Ｆ×（１１／２）×（１／１０）×（１／Ｗ）

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対応するチロシンの量（μｇ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

検量線の作成

　(�@)の検量線の作成を準用する。

(�B)　第３法

基質溶液の調製

　(�@)の基質溶液の調製を準用する。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が１０から３０たん白消化力単位となるように水を加えて溶かし、試料溶液とする。必要ならば、ろ過又は遠心分離を行う。基質溶液５ｍＬを正確に量り、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加え直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に１０分間放置する。次に、トリクロル酢酸試液Ａ５ｍＬを加えて振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置する。さらに、この液をろ過して沈殿物を完全に除去した後、ろ液２ｍＬを正確に量り、０．５５ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム試液５ｍＬ及び薄めたフォリン試液（１→３）１ｍＬを加えてよく振り混ぜ、３７±０．５゜で３０分間放置した後、この液につき、波長６６０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。別に試料溶液１ｍＬを正確に量り、トリクロル酢酸試液Ａ５ｍＬを加えて振り混ぜ、基質溶液５ｍＬを正確に加え、３７±０．５゜で３０分間放置する。以下同様の方法で操作して、吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。

　１ｇ中のたん白消化力単位＝（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｔ′）×Ｆ×（１１／２）×（１／１０）×（１／Ｗ）

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対応するチロシンの量（μｇ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

検量線の作成

　(�@)の検量線の作成を準用する。

�F　でんぷん糖化力試験法

　でんぷん糖化力試験法は、デンプンにアミラーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する還元力により、飼料添加物中のアミラーゼの量を測定する方法であり、その単位は、でんぷん糖化力単位で示す。

　１でんぷん糖化力単位は、アミラーゼがバレイショデンプンに３７゜で作用するとき反応初期の１分間に１ｍｇのブドウ糖に相当する還元力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　あらかじめバレイショデンプン約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで２時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物１ｇに対応するバレイショデンプンを正確に量り、三角フラスコに入れ、水２０ｍＬを加えてよく振り混ぜながら徐々に２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液５ｍＬを加えてのり状とし、水浴中で振り混ぜながら３分間加熱した後、水２５ｍＬを加え、冷後２ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液で正確に中和し、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した１ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍＬを加え、更に水を加えて正確に１００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が０．４から０．８でんぷん糖化力単位となるように、水又は試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．１ｍｏｌ／Ｌ乳酸塩緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。必要ならば、ろ過又は遠心分離を行う。基質溶液１０ｍＬを正確に量り、直径３０ｍｍの試験管に入れ、３７±０．５゜で１０分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加え、直ちに振り混ぜ、３７±０．５゜で正確に１０分間放置する。次に、フェーリング試液のアルカリ性酒石酸塩液２ｍＬを加えて直ちに振り混ぜ、更にフェーリング試液の銅液２ｍＬを正確に加え、軽く振り混ぜた後、試験管の口に漏斗をのせ、水浴中で正確に１５分間加熱し、直ちに流水で２５゜以下に冷却する。さらに、濃ヨウ化カリウム試液２ｍＬ及び薄めた硫酸（１→６）２ｍＬを加え、遊離したヨウ素を直ちに０．０５ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム液で滴定する（指示薬　溶性デンプン試液１から２滴）。この場合において、滴定の終点は、液の青色が消えたときとし、その滴定量をＡｍＬとする。別に基質溶液１０ｍＬの代わりに水１０ｍＬをとり、以下同様の方法で操作し、その滴定量をＢｍＬとする。

　１ｇ中のでんぷん糖化力単位＝（Ｂ−Ａ）×１．６×（１／１０）×（１／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

�G　フィチン酸分解力試験法

　フィチン酸分解力試験法は、フィチン酸にフィターゼが作用するときに、加水分解によって生成されるリン酸イオンの量により、飼料添加物中のフィターゼの量を測定する方法であり、その単位は、フィチン酸分解力単位で示す。

　１フィチン酸分解力単位は、フィターゼがフィチン酸に３７ﾟで作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルのリン酸を遊離させる酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　あらかじめフィチン酸ナトリウムをデシケーター（シリカゲル）中で２４時間以上乾燥し、その０．２７１ｇを正確に量り、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２mol/Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液約５０mLを加えて溶かし、０．２mol/Ｌ酢酸試液を加えてpH５．５に調整後、同緩衝液で正確に１００mLとする。

反応停止発色液の調製

　モリブデン酸アンモニウム１．２３５ｇに水を加えて溶かし１００mLとし、モリブデン酸アンモニウム試液を調製する。モリブデン酸アンモニウム試液１容量に、２．５mol/Ｌ硫酸試液１容量とアセトン２容量を加え、よく振り混ぜ直ちに氷中で冷却する。反応停止発色液は用時製する。

操作法

　試料適量を精密に量り、１mL当たりの濃度が０．０４〜０．０６フィチン酸分解力単位となるように、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．００５mol/Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、必要があれば、ろ過して試料溶液とする。基質溶液０．５mLを正確に量り、１０mLの丸底遠沈管又は試験管に入れ、３７±０．５ﾟに加温する。この基質溶液に、別に３７±０．５ﾟに加温した試料溶液０．５mLを正確に加え、直ちに振り混ぜ、３７±０．５ﾟで正確に10分間放置する。その後、氷中で冷却した反応停止発色液２mLを正確に加えてよくかき混ぜ、更に１mol/Ｌクエン酸試液０．１mLを正確に加えてよくかき混ぜる。この液につき、５分以内に水を対照液として波長３８０nmにおける吸光度ＯＤＴを測定する。別に、試料溶液0.5mLを正確に量り、氷中で冷却した反応停止発色液２mLを正確に加えてよくかき混ぜた後、基質溶液0.5mLを正確に加えてよくかき混ぜ、１mol/Ｌクエン酸試液０．１mLを正確に加え、更によくかき混ぜる。以下同様の方法で操作して吸光度ＯＤ_ＴＢを測定する。を測定する。

　１ｇ中のフィチン酸分解力単位＝（ＯＤ_Ｔ−ＯＤ_ＴＢ）×Ｆ×２×（１／１０）×（１／Ｗ）×Ｚ

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対応するリン酸イオン濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）

　Ｗ：試料採取量（ｇ）

　Ｚ：希釈倍率

検量線の作成

　リン酸二水素カリウムをデシケーター（シリカゲル）中で２４時間以上乾燥し、その０．６８０ｇを正確に量り、水を加えて溶かし、正確に１，０００mLとする。この液１mL、２mL、３mL及び４mLを正確に量り、それぞれに水を加えて正確に５０mLとする。それぞれの液１mLを正確に量り、氷中で冷却した反応停止発色液２mLを正確に加えてよくかき混ぜ、更に１mol/Ｌクエン酸試液０．１mLを正確に加えてよくかき混ぜる。この液につき、水を対照液として波長３８０nmにおける吸光度ＯＤ_Ｓ１、ＯＤ_Ｓ２、ＯＤ_Ｓ３及びＯＤ_Ｓ４を測定する。別に、水１mLを正確に量り、氷中で冷却した反応停止発色液２mLを正確に加えてよくかき混ぜ、更に１mol/Ｌクエン酸試液０．１mLを正確に加えてよくかき混ぜる。この液につき、水を対照液として波長３８０nmにおける吸光度ＯＤ_ＳＢ測定する。リン酸イオン濃度を縦軸に吸光度差（ＯＤ_Ｓ１−ＯＤ_ＳＢ）、（ＯＤ_Ｓ２−ＯＤ_ＳＢ）、（ＯＤ_Ｓ３−ＯＤ_ＳＢ）及び（ＯＤ_Ｓ４−ＯＤ_ＳＢ）を横軸にとり、検量線を作成する。

基質溶液の調製

　フィチン酸ナトリウム０．８ｇを正確に量り、ｐＨ５．５に調整した０．２５mol/Ｌ 酢酸塩酸緩衝液を加えて溶かし、塩酸でｐＨ５．５に調整後、同緩衝液にて正確に１００mLとする。

反応停止発色液の調製

　モリブデン酸アンモニウム１００ｇを水８００mLに溶かし、２５％アンモニア水１０mLを加えた後、水を加えて１，０００mLとし、モリブデン酸アンモニウム試液を調製する。バナジン酸アンモニウム２．３５ｇに５０°に温めた水４００mLを加えて溶かし、薄めた硝酸（１→３）20mLを加えて、さらに水を加えて１，０００mLとしバナジン酸アンモニウム試液とする。モリブデン酸アンモニウム試液１容量に、バナジン酸アンモニウム試液１容量と薄めた硝酸（１→３）２容量を加えて混合する。反応停止発色液は用時製する。

操作法

　試料溶液は各条で規定する方法で調製する。基質溶液０．８mLを正確に量り、２mLのプラスチック製遠沈管に入れ、３７±０．５ﾟに加温し５分間放置する。この基質溶液に、別に３７±０．５ﾟに加温し５分間放置した試料溶液０．０４mL及び各条に定める希釈液０．３６mLを正確に加え、３７±０．５ﾟに加温し３０分間放置する。その後、反応停止発色液０．８mLを正確に加えてよくかき混ぜ室温で１０分間放置する。さらに、毎分１４，０００回転で３分間遠心分離を行い、得られた上澄液につき、水を対照として、波長４１５nmにおける吸光度ODＴを測定する。別に、希釈液０．４mLを正確に量り、これに反応停止発色液０．８mLを加えてかき混ぜた後、基質溶液０．８mLを加え、１０分間室温で放置する。以下同様の方法で操作して吸光度ＯＤＢを測定する。

　１ｇ中のフィチン酸分解力単位＝(ＯＤ_Ｔ−ＯＤ_Ｂ)×Ｆ×(１／３０)×(１／Ｗ)×Ｚ

　Ｆ：検量線から求めた吸光度差１に対応するリン酸イオン濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）

　Ｗ：試料採取量（ｇ）

　Ｚ：希釈倍率

検量線の作成

　１０５ﾟで２時間乾燥させた後デシケーターで保存したリン酸二水素カリウム０．６８２ｇを正確に量り、希釈液を加えて溶かし、正確に１００mLとする。この液３mL、６mL、１２mL及び２５mLを正確に量り、それぞれに希釈液を加えて正確に５０mLとする。試料溶液と同様に操作法に従い、ＯＤ_Ｓ１、ＯＤ_Ｓ２、ＯＤ_Ｓ３及びＯＤ_Ｓ４を測定する。リン酸イオン濃度を縦軸に、操作法に従い測定したＯＤ_Ｂとの吸光度差（ＯＤ_Ｓ１−ＯＤ_Ｂ)、(ＯＤ_Ｓ２−ＯＤ_Ｂ)、(ＯＤ_Ｓ３−ＯＤ_Ｂ)及び(ＯＤ_Ｓ４−ＯＤ_Ｂ)を横軸にとり､検量線を作成する。

�H　ペクチン液化力試験法

　ペクチン液化力試験法は、ペクチンにペクチナーゼが作用するときに、ペクチンの全体的低分子化に伴つて低下するペクチンの粘度により、飼料添加物中のペクチンの量を測定する方法であり、その単位は、ペクチン液化力単位で示す。

　１ペクチン液化力単位は、ペクチナーゼが１％のペクチン溶液に、３７゜で１０分間作用するとき、その粘度を半減させる酵素量に相当する。

装置

　測定装置として図に示す粘度計を用いる。

　図　（略）

基質溶液の調製

　あらかじめペクチン約１ｇを精密に量り、１０５ﾟで２時間乾燥し、その減量を測定する。その乾燥物２．０ｇに対応するペクチンを正確に量り、水５０ｍＬを加えて加温して溶かし、冷後、水を加えて正確に１００ｍＬとする。

操作法

　試料適量をそれぞれ精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が約０．５ペクチン液化力単位、約１．０ペクチン液化力単位及び約２．０ペクチン液化力単位となるように、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を加えて溶かし、試料溶液Ａ、Ｂ及びＣとする。

　基質溶液５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液４ｍＬを粘度計の管Ｄから球Ａに入れ、３７±０．５゜の水浴中に１０分間放置した後、試料溶液Ａ１ｍＬを加え、直ちによく振り混ぜ、３７±０．５゜の水浴中に１０分間放置する。粘度計の管Ｅから静かに吸引して液面を球Ｃの中心部まで引き上げた後、吸引をやめ、直ちに重力により流下させ、液面が球Ｂの上の標線から下の標線まで流下するのに要する時間ｔａ_１を測定する。別に水５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液４ｍＬを粘度計の管Ｄから球Ａに入れ、３７± ０．５゜の水浴中に１０分間放置した後、試料溶液Ａ１ｍＬを加え、直ちによく振り混ぜ、３７±０．５゜の水浴中に正確に１０分間放置する。以下同様の方法で粘度計を操作して、流下時間ｔａ_２を測定し、Ｔ_Ａ（ｔａ_１−ｔａ_２）を求める。次に、別に試料溶液Ｂ及びＣにつき、試料溶液Ａと同様の方法で操作し、Ｔ_Ｂ（ｔｂ_１−ｔｂ_２）及びＴ_Ｃ（ｔｃ_１−ｔｃ_２）を求める。

　さらに、別に基質溶液５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液５ｍＬを粘度計の管Ｄから球Ａに入れ、直ちによく振り混ぜ、３７±０．５゜の水浴中に１０分間放置する。以下同様の方法で粘度計を操作して、流下時間ｔ０１を測定する。別に水５ｍＬ及び試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整した０．２ｍｏｌ／Ｌ酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液５ｍＬを粘度計の管Ｄから球Ａに入れ、直ちによく振り混ぜ、３７±０．５゜の水浴中に１０分間放置する。以下同様の方法で粘度計を操作して、流下時間ｔ_０２を測定し、Ｔ_０（ｔ_０１−ｔ_０２）を求める。

　片対数グラフの縦軸にＴ_Ａ、Ｔ_Ｂ及びＴ_Ｃを、横軸（対数尺）に試料溶液Ａ、Ｂ及びＣそれぞれの１ｍＬ中に含まれる試料の量（ｇ）をとり、Ｔ_０／２に対応する試料の量Ｗ（ｇ）を求める。

　１ｇ中のペクチン液化力単位＝１／Ｗ

�I　ペクチン糖化力試験法

　ペクチン糖化力試験法は、ペクチンにペクチナーゼが作用するときに、加水分解に伴つて増加する還元力により、飼料添加物中のペクチンの量を測定する方法であり、その単位は、ペクチン糖化力単位で示す。

　１ペクチン糖化力単位は、ペクチナーゼがペクチンに４０゜で作用するとき、反応初期の１時間に１マイクロモルのガラクツロン酸に相当する還元力の増加をもたらす酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　ペクチン０．６５ｇを正確に量り、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整したクエン酸塩緩衝液に徐々に加えながら激しく振り混ぜて溶かし、更に同緩衝液を加えて正確に１００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が２５から３５ペクチン糖化力単位となるように、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整したクエン酸塩緩衝液を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、時々かき混ぜながら１時間放置した後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。基質溶液１０ｍＬを正確に量り、１００ｍＬのヨウ素フラスコに入れ、４０±０．２゜の水浴中に５分間放置した後、試料溶液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、直ちに４０±０．２゜の水浴中で正確に１時間放置する。次に、炭酸ナトリウム試液２．５ｍＬを加えてよく振り混ぜ、更に０．１ｍｏｌ／Ｌヨウ素液５ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、４０分間暗所に放置した後、薄めた硫酸（１２→１００）５ｍＬを加え、よく振り混ぜ、直ちに０．０１ｍｏｌ／Ｌチオ硫酸ナトリウム液で滴定する（指示薬　デンプン試液１ｍＬ）。この場合において、滴定の終点は、液の青色が消えたときとし、その滴定量をＡｍＬとする。別に基質溶液１０ｍＬを正確に量り、１００ｍＬのヨウ素フラスコに入れ、炭酸ナトリウム試液２．５ｍＬを加えてよく振り混ぜた後、試料溶液１ｍＬを正確に加え、よく振り混ぜ、更に０．１ｍｏｌ／Ｌヨウ素液５ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜ、以下同様に操作し、その滴定量をＢｍＬとする。

　１ｇ中のペクチン糖化力単位＝〔（Ｂ−Ａ）×２−３〕×０．０１×５１３×（１／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

�J　ラクターゼ試験法

　ラクターゼ試験法は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドにラクターゼが作用するときに、加水分解によつて生成されるｏ−ニトロフェノールの量により、飼料添加物中のラクターゼの量を測定する方法であり、その単位はラクターゼ単位で示す。

　１ラクターゼ単位は、ラクターゼがｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドに３０゜で作用するとき、反応初期の１分間に１マイクロモルのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが加水分解する酵素量に相当する。

基質溶液の調製

　ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．１７２ｇを正確に量り、試料の最大酵素活性を示すｐＨに調整したマッキルベイン緩衝液に溶かして正確に１００ｍＬとする。

操作法

　試料適量を精密に量り、１ｍＬ当たりの濃度が０．０５〜０．０８ラクターゼ単位となるように水を加えて溶かし、試料溶液とする。試料が完全に溶けない場合には、時々かき混ぜながら１時間放置した後、遠心分離し、その上澄液を試料溶液とする。基質溶液３．５ｍＬを正確に量り、３０゜に加温し、試料溶液０．５ｍＬを正確に加え、３０゜で正確に１０分間放置した後、炭酸ナトリウム試液１ｍＬを正確に加え振り混ぜ、この液につき波長４２０ｎｍにおける吸光度Ａ_Ｔを測定する。別に基質溶液３．５ｍＬを正確に量り、３０゜に加温し、炭酸ナトリウム試液１ｍＬを正確に加えてよく振り混ぜた後、更に試料溶液０．５ｍＬを正確に加え、３０゜で正確に１０分間放置し、この液につき、同様に吸光度Ａ_Ｔ′を測定する。

　１ｇ中のラクターゼ単位＝（（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｔ′）／０．９０）×（１／１０）×

（２／Ｗ）

　Ｗ：試料溶液１ｍＬ中の試料の量（ｇ）

(15)　１，４−ジオキサン試験法

　１，４−ジオキサン試験法は、乳化剤中に混在する１，４−ジオキサンの限度試験である。

装置

　図に示すものを用いる。

　図　（略）

操作法

　試料約２０ｇを精密に量り、ナス型フラスコＥに入れる。試料が半固体又はワックス状の場合は、水浴上で加熱し液状とした後入れる。これに、試料が結晶状の場合は１．５ｍＬの水、また、液状、半固体及びワックス状の場合は１．０ｍＬの水を加える。なお、試料の水分含量が多い場合は、水の絶対量が１．０〜１．５ｍＬとなるように調整する。マグネチックスターラーを用いて水と試料をよくかき混ぜた後、フラスコＥを氷浴中に浸し、約１分間冷却する。次に、フラスコＥと濃縮管Ｄを接続する管にリボンヒーターを巻き、約１０〜１５Ｖの電圧で通電する。フラスコＥ及び濃縮管Ｄを蒸留装置に取り付け、各々のジョイントに、高圧真空用シリコングリースを塗布する。真空トラップ管Ｆを、液体窒素を満たしたデュワーびんに浸し、コックＢを閉じ、次にコックＣを開いて真空ポンプを作動させる。フラスコＥをドライアイス・メタノール浴に約１０分間浸し、真空度が０．００７ｋＰａ以下になつたとき、コックＢを２０秒間開き、再び閉じる。ドライアイス・メタノール浴を除き、約１分間室温に放置した後、２０〜２５ﾟの水浴中に約５分間浸す。水浴の温度を３５〜４０ﾟに上げ（大部分の試料が液状になる。）、マグネチックスターラーを用いて試料を完全に溶解させた後、氷水中で２分間冷却する。次に、水浴をドライアイス・メタノール浴に取り替えて約１０分間浸し、内容物を凍結させ、コックＢを２０秒間開き、再び閉じる。ドライアイス・メタノール浴を除いて水浴中に浸し、水浴の温度を４５〜５０ﾟに上げ、試料が完全に溶解するまでかくはんする。このとき、フラスコＥと濃縮管Ｄとの連結管に濃縮物が認められる場合は、リボンヒーターの電圧をゆつくり上げ、濃縮物が消失するまで加熱する。更に、試料をかくはんしながら、濃縮管Ｄを液体窒素を満たしたデュワーびんに破損しないように注意してゆつくり浸す。水が管中で蒸留を始め、濃縮管Ｄに氷ができれば、氷の面のやや下に液体窒素面を保つようにデュワーびんを少しずつ上げていく。濃縮管Ｄの首まで水が凍るか、又は濃縮管Ｄの２．０ｍＬの目盛まで液体窒素面を上げたときに、デュワーびんを除き、室温で氷を溶かす。氷が溶けた後、蒸留された水の量が０．９ｍＬ以上になるまで冷却と加温を連続して繰り返す。濃縮管Ｄを再び２分間冷却して内容物を凍結させ、コックＣを開いて真空を解除した後、真空ポンプを停止し、コックＢを開く。濃縮管Ｄを取り外し、栓をして室温で氷を溶かす。濃縮管Ｄに水を加えて正確に２．０ｍＬとした後、均一になるまでかくはんして試料溶液とする。試料溶液及び１，４−ジオキサン測定用標準溶液につき、次の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行い、各々のピーク高さを測定する。

操作条件

　検出器：水素炎イオン化検出器

　カラム：内径３ｍｍ、長さ２．０ｍのガラス管又はステンレス管に１４９〜１７７μｍのガスクロマトグラフ用多孔性アクリロニトリルジビニルベンゼン重合体又はこれと同等のものを充てんする。

　カラム温度：１４０〜１５０ﾟの一定温度

　キャリアガス及び流量：ジオキサンが約４０分後に現われるように窒素の流量を調節する。

１，４−ジオキサン測定用標準溶液の調製

　ジオキサン１．０００ｇを正確に量り、水を加えて正確に１００ｍＬとする。この液を１ｍＬ正確に量り、水を加えて正確に１００ｍＬとする。冷所に保存し、一週間以内に使用する。

(16)　重金属試験法

　重金属試験法は、試料中に混在する重金属の限度試験である。この重金属とは、酸性で硫化ナトリウム試液によつて呈色する金属性混在物をいい、その量は鉛（Ｐｂ）の量として表わす。

　各条には、重金属（Ｐｂとして）の限度をｐｐｍで（　）内に付記する。

操作法

　検液及び比較液の調製法は、別に規定する場合を除き、次の方法による。

�@　第１法

　各条に規定する量の試料をネスラー管にとり、水適量を加えて溶かし、４０ｍＬとする。これに希酢酸２ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとし、検液とする。

　比較液は各条に規定する量の鉛標準液をネスラー管にとり、希酢酸２ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとする。

�A　第２法

　各条に規定する量の試料を石英製又は磁製のるつぼに量り、ゆるくふたをし、弱く加熱して炭化する。冷後、硝酸２ｍＬ及び硫酸５滴を加え、白煙の生じるまで注意して加熱した後、５００〜６００ﾟで強熱し、灰化する。冷後、塩酸２ｍＬを加え、水浴上で蒸発乾固し、残留物を塩酸３滴で潤し、熱湯１０ｍＬを加えて２分間加温する。次にフェノールフタレイン試液１滴を加え、アンモニア試液を液が微赤色となるまで滴加し、希酢酸２ｍＬを加え、必要ならばろ過し、水１０ｍＬで洗い、ろ液及び洗液をネスラー管に入れ、水を加えて５０ｍＬとし、検液とする。

　比較液は硝酸２ｍＬ、硫酸５滴及び塩酸２ｍＬを水浴上で蒸発し、さらに砂浴上で蒸発乾固し、残留物を塩酸３滴で潤し、以下検液の調製法と同様に操作し、各条に規定する量の鉛標準液及び水を加えて５０ｍＬとする。

�B　第３法

　各条に規定する量の試料を石英製又は磁製のるつぼに量り、初めは注意して弱く加熱し、次いで強熱して灰化する。冷後、王水１ｍＬを加え、水浴上で蒸発乾固し、残留物を塩酸３滴で潤し、熱湯１０ｍＬを加えて２分間加温する。次にフェノールフタレイン試液１滴を加え、アンモニア試液を液が微赤色となるまで滴加し、希酢酸２ｍＬを加え、必要ならばろ過し、水１０ｍＬで洗い、ろ液及び洗液をネスラー管に入れ、水を加えて５０ｍＬとし、検液とする。

　比較液は王水１ｍＬを水浴上で蒸発乾固し、以下検液の調製法と同様に操作し、各条に規定する量の鉛標準液及び水を加えて５０ｍＬとする。

　検液の試験は、別に規定する場合を除き、次の方法による。

　検液及び比較液に硫化ナトリウム試液１滴ずつを加えて混和し、５分間放置した後、両管を白色の背景を用い、上方又は側方から観察して液の色を比較する。

　このとき検液の呈する色は、比較液の呈する色より濃くてはならない。

(17)　水分定量法（カールフィシャー法）

　水分定量法は、メタノール及びピリジンの存在で、水がヨウ素及び二酸化イオウと次の式に示すように定量的に反応することを利用して水分を定量する方法である。

　Ｈ_２Ｏ+Ｉ_２+ＳＯ_２+３Ｃ_５Ｈ_５Ｎ＝２（Ｃ_５Ｈ_５Ｎ⁺Ｈ）Ｉ⁻＋Ｃ_５Ｈ_５Ｎ・ＳＯ_３

　Ｃ_５Ｈ_５Ｎ・ＳＯ_３＋ＣＨ_３ＯＨ＝（Ｃ_５Ｈ_５Ｎ⁺Ｈ）Ｏ⁻ＳＯ_２・ＯＣＨ_３

装置

　通例、自動ビュレット２本、滴定フラスコ（２５０ｍＬ）、かき混ぜ器及び定電圧電流滴定装置からなる。カールフィシャー試液は吸湿性が非常に強いので、装置は外部からの吸湿を防ぐようにする。防湿には、シリカゲル又は塩化カルシウム（水分測定用）等を用いる。

試薬・試液

　カールフィシャー用メタノール　メタノール１，０００ｍＬにマグネシウム末５ｇを加え、水分吸収管（水分測定用塩化カルシウム）を付けた還流冷却器を装置して加熱し、必要ならば、塩化第二水銀０．１ｇを加えて反応を促進させる。ガスの発生がやんだ後、湿気をさえぎつてメタノールを蒸留し、湿気を避けて保存する。本品１ｍＬ中の水分は０．５ｍｇ以下とする。

　カールフィシャー用ピリジン　ピリジンに水酸化カリウム又は酸化バリウムを加え、密せんして数日間放置した後、そのまま湿気をさえぎつて蒸留し、湿気を避けて保存する。本品１ｍＬ中の水分は１ｍｇ以下とする。

カールフィシャー試液

　調製　ヨウ素６３ｇをカールフィシャー用ピリジン１００ｍＬに溶かし、氷冷し、乾燥二酸化イオウを通じ、その増量が３２．３ｇに達したとき、二酸化イオウを通じることをやめ、カールフィシャー用メタノールを加えて５００ｍＬとし、２４時間以上放置した後用いる。この試液は日時の経過とともに変化するので用時標定する。しや光して湿気を避け、冷所に保存する。

　標定　操作法に従い、カールフィシャー用メタノール２５ｍＬを乾燥滴定フラスコにとる。これをあらかじめカールフィシャー試液で終点まで滴定してフラスコ内を無水の状態にしておく。次に水約５０ｍｇを精密に量り、速やかに滴定フラスコに入れ、激しくかき混ぜながら、カールフィシャー試液で終点まで滴定する。カールフィシャー試液の１ｍＬに対応する水（Ｈ_２Ｏ）のｍｇ数ｆを次の式によつて求める。

　ｆ＝水（Ｈ_２Ｏ）の採取量（ｍｇ）／水（Ｈ_２Ｏ）の滴定に要したカールフィシャー試液の量（ｍＬ）

水・メタノール標準液

　調製　カールフィシャー用メタノール５００ｍＬを１，０００ｍＬの乾燥メスフラスコにとり、水２．０ｍＬを加え、カールフィシャー用メタノールを加えて１，０００ｍＬとする。

　この標準液の標定は、カールフィシャー試液の標定に続いて行う。しや光して湿気を避け、冷所に保存する。

　標定　操作法に従い、カールフィシャー用メタノール２５ｍＬを乾燥滴定フラスコにとる。これをあらかじめカールフィシャー試液で終点まで滴定してフラスコ内を無水の状態にしておく。次にカールフィシャー試液１０ｍＬを正確に加え、調製した水・メタノール標準液で終点まで滴定する。水・メタノール標準液１ｍＬ中の水（Ｈ_２Ｏ）のｍｇ数ｆ′を次の式によつて求める。

　′＝（ｆ×１０）／滴定に要した水・メタノールの標準液の量（ｍＬ）

操作法

　カールフィシャー試液による滴定は湿気を避けて行い、原則として、これを標定したときの温度と同一の温度で行う。被滴定液中に２本の白金電極を浸し、可変抵抗器を適当に調節して一定の電流（５〜１０マイクロアンペア）を流しておき、カールフィシャー試液を滴加すると、滴定の進むにつれて回路中のマイクロアンメーターの針が大きく振れ、数秒で再び元の位置に戻る。滴定の終点に達すると、マイクロアンメーターの振れ（５０〜１５０マイクロアンペア）が３０秒間又はそれ以上の間持続する。この状態になつたときを滴定の終点とする。ただし、逆滴定の場合、カールフィシャー試液が過量に存在する間はマイクロアンメーターの針が振り切れ、終点に達すると急に元の位置に戻る。マイクロアンメーターの代わりにマジックアイ付電位差針を用いることもできる。

　カールフィシャー試液による滴定は、別に規定する場合を除き、次のいずれかの方法による。終点は、通例、逆滴定を行う場合の方が明瞭に判別できる。

�@　直接滴定

　別に規定する場合を除き、次の方法による。カールフィシャー用メタノール２５ｍＬを乾燥滴定フラスコにとり、これをあらかじめカールフィシャー試液で終点まで滴定して、フラスコ内を無水の状態にしておく。次に水分１０〜５０ｍｇを含むような量の試料を精密に量り、速やかに滴定フラスコに入れ、かき混ぜて溶かし、激しくかき混ぜながらカールフィシャー試液で終点まで滴定する。試料が溶剤に溶けないときは手早く粉末とし、その重量を計り、速やかに滴定フラスコに入れ、湿気を避けて３０分間かき混ぜた後、激しくかき混ぜながら滴定を行う。

　水（Ｈ_２Ｏ）％＝（（試液の滴定に要したカールフィシャー試液の量（ｍＬ）×ｆ）／試料の量（ｍｇ））×１００

�A　逆滴定

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　カールフィシャー用メタノール２５ｍＬを乾燥滴定フラスコにとり、これをあらかじめカールフィシャー試液で終点まで滴定し、フラスコ内を無水の状態にしておく。次に水分１０〜５０ｍｇを含むような量の試料を精密に量り、速やかに滴定フラスコに入れ、過量のカールフィシャー試液の一定量を加え、かき混ぜて溶かし、激しくかき混ぜながら水・メタノール標準液で終点まで滴定する。試料が溶剤に溶けないときは、手早く粉末とし、その重量を量り、速やかに滴定フラスコに入れ、過量のカールフィシャー試液の一定量を加え、湿気を避けて３０分間かき混ぜた後、激しくかき混ぜながら滴定を行う。

　水（Ｈ_２Ｏ）％＝（（カールフィシャー試液の量（ｍＬ）×ｆ−滴定に要した水・メタノール標準液の量（ｍＬ）×′）／試料の量（ｍｇ））×１００

(18)　生菌剤試験法

　生菌剤試験法は、微生物学的方法又は化学的方法によつて試料中の生菌の同定を行う試験法である。この試験に使用する水、試薬・試液及び計量器・用器は必要に応じ無菌のものを用いる。

培地の種類並びにその組成及びｐＨ

　別に規定する場合を除き、次の表に掲げる組成及びｐＨを有するものを使用する。ただし、培地の成分として単にペプトンと記載してある場合は、カゼイン製ぺプトンを用いても差し支えない。培地のｐＨの調整は、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又は１ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を用い、滅菌後のｐＨが所定のものとなるようにする。

培地 1,000mL の組成	培地番号	１	２	３	４	５	６	７	８	９	10
	カゼイン製ペプトン（ｇ）	5	20	20	10	5	17		10	15
	プロテオーゼペプトン（ｇ）	10							10
	大豆ペプトン（ｇ）	3					3		3	5
	ペプトン（ｇ）							10
	肉エキス（ｇ）	2.4	10	10	5			5	2.2
	塩化ナトリウム（ｇ）	0.01	1.5	1.5	5	0.01	5		3	5	5
	酵母エキス（ｇ）	5	2.2	2.2		5			5
	肝臓エキス（ｇ）	3.2							1.2
	ブドウ糖（ｇ）	10				2	2.5	10
	乳糖（ｇ）		20	20
	ポリソルベート８０（ｍＬ）	1	1						1
	可溶性デンプン（ｇ）	0.5
	リン酸二水素カリウム（ｇ）	1				0.5			2.5
	リン酸一水素カリウム（ｇ）	1				0.5	2.5
	硫酸マグネシウム（ｇ）	0.2				0.3
	硫酸第一鉄（ｇ）	0.01				0.01
	硫酸マンガン（ｇ）	0.007				0.01
	硫酸亜鉛（ｇ）					0.001
	硫酸コバルト（ｇ）					0.001
	硫酸銅（ｇ）					0.001
	Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（ｇ）	0.5							0.3
	シリコン（ｇ）	0.2
	消化血清（ｇ）								13.5
	チオグリコール酸ナトリウム（ｇ）								0.3
	牛心臓抽出液（ｇ）										500
	トリプトース（ｇ）										10
	ブロムクレゾールパープル試液（ｍＬ）										1
	カンテン（ｇ）	15		15	15	15	20			15
	水	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量	適量
	滅菌後のｐＨ	7.1〜7.3	6.9〜7.1	6.9〜7.1	6.9〜7.1	5.9〜6.1	7.2〜7.4	6.4〜7.0	7.2〜7.4	7.2〜7.4	7.3〜7.5

注

１）１号培地及び９号培地は滅菌後、１００ｍＬに対して馬脱繊維血液５ｍＬを加えたものを使用する。

２）５号培地のｐＨ調整は、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液又は希硫酸を用いる。

�@　染色法

　染色法は、生菌を適当な染色液を用いて染色し、生菌の性状、形状及び芽胞の有無を判定する試験法である。

(�@) グラム染色法　次の２つの方法のいずれか適当な方法を用いる。

ア　ＨＵＣＫＥＲの変法

　スライドグラス上に塗抹し、固定した試料にフッカーの染色液２滴を加え、３０〜６０秒間放置して染色した後、スライドグラスを軽く振つて液をきる。次に、ルゴール液を十分に加え、６０秒間放置した後、水洗し、ろ紙で水を吸収する。スライドグラスを軽く動かしながら、脱色液として無水エタノール又はエタノール・アセトン混液（７：３）を用いて洗液がほぼ無色になるまで脱色する。さらに、水洗し、ろ紙で水を吸収する。これにサフラニン溶液（１→２００）２滴を加え、６０秒間放置し、後染色（対比染色）した後、水洗し、乾燥する。

イ　Ｌｉｌｌｉｅの変法

　スライドグラス上に塗抹し、固定した試料にリリーの染色液２滴を加え、３０秒間放置して染色した後、スライドグラスを軽く振つて液をきる。次に、ヨウ素・ルゴール試液で数回洗つた後、ヨウ素・ルゴール試液３滴を加え、３０秒間放置する。ヨウ素・アセトン試液で十分に洗い流した後、ヨウ素・アセトン試液３滴を加え、３０秒間放置する。次いで水洗し、ろ紙で水を吸収する。これに弱石炭酸フクシン液２滴を加え、３０秒間放置し、後染色（対比染色）した後、水洗し、乾燥する。

　スライドグラス上に塗抹し、固定した試料にマラカイトグリーン溶液（１→２０）で１〜３分間、加温又は加熱して染色した後、約３０秒間水洗し、乾燥する。乾燥した塗抹面にサフラニン溶液（ｌ→２００）１〜３滴を加え、１５〜３０秒間染色した後、水洗し、乾燥する。

�A　糖分解能力試験法

　糖分解能力試験法は、生菌を培養して培養液のｐＨを測定等することにより生菌の糖の分解能力の有無を判定する試験法である。次の２つの方法のいずれか適当な方法を用いる。

(�@) 第１法

　各条に規定する培地に生じた集落を白金耳でとり、８号培地１０ｍＬ及び各条に規定する糖の水溶液（３→１０）をろ過滅菌した後、ろ液０．３ｍＬを加えた８号培地１０ｍＬにそれぞれ接種し、３６〜３８゜で７日間嫌気培養し、対照溶液及び試料溶液とする。ｐＨ測定法により対照溶液及び試料溶液のｐＨを測定し、対照溶液のｐＨから試料溶液のｐＨを引いた値が１未満のときを陰性、１以上のときを陽性とする。

(�A) 第２法

　各条に規定する培地に生じた集落を白金耳でとり、各条に規定する糖の水溶液（３→１０）をろ過滅菌した後、ろ液０．１ｍＬを加えた１０号培地３ｍＬに接種し、３６〜３８゜で７日間培養し、試料溶液とする。

　別に、陰性対照として１０号培地３ｍＬに、陽性対照としてブドウ糖溶液（３→１０）をろ過滅菌した後、ろ液０．１ｍＬを加えた１０号培地３ｍＬにそれぞれ菌を接種し、同様の操作を行う。

　試料溶液が青紫色を呈した場合を陰性、黄色を呈した場合を陽性とする。同時に、陰性対照が青紫色を、陽性対照が黄色を呈することを確認する。

�B　乳酸生成能力試験法

　乳酸生成能力試験法は、生菌を培養して培養液中の乳酸を測定することにより生菌の乳酸の生成能力の有無を判定する試験法である。試料溶液及び標準溶液の調製

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　各条に規定する試料原液又は培地に生じた集落を白金耳でとり、２号培地１０ｍＬに接種し、３６〜３８゜で７日間培養し、試料原液とする。別に、乳酸１．０ｍＬに水を加え１００ｍＬとし、これを標準原液とする。試料原液０．５ｍＬ及び標準原液０．５ｍＬにそれぞれ薄めた硫酸（１→２）０．２ｍＬ及びメタノール１．０ｍＬを加え、６０゜で３０分間加熱した後、直ちに冷却する。これに水０．５ｍＬ及びクロロホルム０．２５ｍＬをそれぞれ加え、緩やかに２０回、転倒混和した後静置し、下層を試料溶液及び標準溶液とする。

　ただし、エンテロコッカス　フェカーリス、エンテロコッカス　フェシウム及びバチルス　コアグランスは好気培養し、ラクトバチルス　アシドフィルス及びラクトバチルス　サリバリウスは嫌気培養する。

操作法

　試料溶液及び標準溶液各１μＬにつき次の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行うとき、試料溶液から得たピークの保持時間は、標準溶液から得たピークの保持時間に一致する。

操作条件

　検出器：水素炎イオン化検出器

　カラム：内径約３ｍｍ、長さ１〜２ｍのガラス管に１４９〜１７７μｍのＦＦＡＰ（１０％）及びリン酸（１％）を含むケイソウ土白色担体又はこれと同等のものを充てんする。

　キャリアーガス：窒素

　燃料ガス：水素

　助燃ガス：空気

　流量：乳酸メチルのピークが適当な時間で完全に分離するように調整する。

　カラム槽温度：１７０゜

　試料導入部温度：２１０゜

　検出器槽温度：２２０゜

�C　酪酸生成能力試験法

　酪酸生成能力試験法は、生菌を培養して培養液中の酪酸を測定することにより生菌の酪酸の生成能力の有無を判定する試験法である。試料溶液及び標準溶液の調整

　各条に規定する試料原液又は培地に生じた集落を白金耳でとり、７号培地１０ｍＬに接種し、３６〜３８゜で７日間嫌気培養し、試料原液とする。別に、酪酸１．０ｍＬにジエチルエーテルを加え１００ｍＬとし、これを標準原液とする。試料原液０．５ｍＬ及び標準原液０．５ｍＬにそれぞれ薄めた硫酸（１→２）０．１ｍＬ及びジエチルエーテル０．５ｍＬを加え、緩やかに２０回、転倒混和した後静置し、上層を試料溶液及び標準溶液とする。

操作法

　試科溶液及び標準溶液各１μＬにつき次の条件でガスクロマトグラフ法により試験を行うとき、試料溶液から得たピークの保持時間は、標準溶液から得たピークの保持時間に一致する。

操作条件

　検出器：水素炎イオン化検出器

　カラム：内径約３ｍｍ、長さ１〜２ｍのガラス管に１４９〜１７７μｍのＦＦＡＰ（１０％）及びリン酸（１％）を含むケイソウ土白色担体又はこれと同等のものを充てんする。

　キャリアーガス：窒素

　燃料ガス：水素

　助燃ガス：空気

　流量：酪酸のピークが適当な時間で完全に分離するように調整する。

　カラム槽温度：１７０゜

　試料導入部温度：２１０゜

　検出器槽温度：２２０゜

(19)　生菌剤定量法

　生菌剤定量法は、微生物学的方法によつて試料中の生菌の菌数の測定を行う試験法である。この試験に使用する水、試薬・試液及び計量器・用器は必要に応じ無菌のものを用いる。

希釈液

　希釈液は、次に掲げる組成及びｐＨを有するものを滅菌して使用する。

１号希釈液（ｐＨ７．０）

　カゼイン製ペプトン１ｇ及び塩化ナトリウム５ｇに水約７５０ｍＬを加えて溶かし、ｐＨを６．９〜７．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

２号希釈液（ｐＨ７．０）

　リン酸二水素カリウム４．５ｇ、リン酸一水素ナトリウム１２水塩６ｇ、ポリソルベート８０　０．５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物０．５ｇ及びカンテン０．５ｇに水約７５ＯｍＬを加えて溶かし、ｐＨを６．９〜７．１に調整した後、更に水を加えて１，０００ｍＬとする。

培地の種類並びにその組成及びｐＨ

　(18)の生菌剤試験法の項を準用する。

試料溶液の調製

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　本品約１ｇを精密に量り、希釈液を正確に５０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、試料原液とする。この原液１ｍＬを正確に量り、別に正確に量つた希釈液９ｍＬに加え、１０倍に希釈する。この操作を繰り返し、１ｍＬ中に生菌を３０〜３００個を含む濃度に又は３００〜３，０００個含む濃度に調製し、試料溶液とする。

　なお、必要に応じて希釈時に界面活性剤を用いる。

操作法

　試料溶液が１ｍＬ中に生菌を３０〜３００個含む濃度の場合は第１法を、１ｍＬ中に生菌を３００〜３，０００個含む濃度の場合は第２法を用いる。

�@　第１法

　試料溶液１ｍＬずつを５枚のペトリ皿に入れ、これに５０゜に保つた試験用寒天培地を２０ｍＬずつ加えて直ちに混和し、固化させる。必要があれば、ペトリ皿の底に試験用寒天培地で基層を作り、上記操作を行つた後、更に試験用寒天培地を加えて重層とする。これを３６〜３８゜で各条に規定する期間培養して出現した集落を数え、平均集落数を求める。

　試料１ｇ中の生菌数＝（平均集落数×希釈倍率×５０）／試料採取量（ｇ）

　希釈倍率：１０倍希釈法による希釈倍数

�A　第２法

　あらかじめ試験用寒天培地を２０ｍＬずつ加えて固化させた５枚のペトリ皿に試料溶液０．１ｍＬずつを入れて塗布する。これを各条に規定する温度で各条に規定する期間培養して出現した集落数を数え、平均集落数を求める。

　試料１ｇ中の生菌数＝（平均集落数×希釈倍率×５００）／試料採取量（ｇ）

　希釈倍率：１０倍希釈法による希釈倍数

(20)　赤外吸収スペクトル測定法

　赤外吸収スペクトル測定法は、赤外線が試料を通過するときに吸収される度合を、各波数（波長）について測定する方法である。赤外吸収スペクトルは横軸に波数（波長）を、縦軸に通常透過率又は吸光度をとつたグラフで示される。赤外吸収スペクトルはその物質の化学構造によつて定まる。したがつて種々の波数（波長）における吸収を測定して物質を確認又は定量することができる。

装置

　複光束式赤外分光光度計を用いる。

　あらかじめ分光光度計を調整した後、測定を行う。特に透過率の直線性は２０〜８０％の間で偏差が１％以内、透過率の再現性は２回繰り返し測定し±０．５％、波数の再現性は波数３，０００ｃｍ^−１付近で±５ｃｍ^−１、１，０００ｃｍ^−１付近で±１ｃｍ^−１以内とする。波数目盛りは、通例、ポリスチレン膜の３，０６０ｃｍ^−１、１，６０１ｃｍ^−１、１，０２９ｃｍ^−１、９０７ｃｍ^−１等の吸収帯を用いて補正する。

操作法

　試料は、主な吸収帯の透過率が２０〜８０％の範囲になるように次のいずれかの方法によつて調製する。窓板は、塩化ナトリウム、臭化カリウム、臭化ヨウ化タリウム等を使用する。

�@　臭化カリウム錠剤法

　固体試料１〜２ｍｇをめのう製乳鉢で粉末とし、これに赤外用臭化カリウム１００〜２００ｍｇを加え、湿気を吸わないように注意し、速やかによくすり混ぜた後、錠剤成形器に入れ、０．６７ｋＰａ以下の減圧下に錠剤の単位面積（ｃｍ２）当たり５，０００〜１０，０００ｋｇの圧力を５〜８分間加えて製錠し測定する。

�A　溶液法

　各条に規定する方法で調製した試料溶液を液体用固定セルに注入し測定する。補償光路側には使用した溶媒を置く。固定セルの厚さは、通例、０．１ｍｍ又は０．５ｍｍとする。

�B　ペースト法

　固定試料をめのう製乳鉢で粉末とし、流動パラフィンなどを加えてよく練り合わせ、空気が入らないように注意しながら２枚の窓板の間にはさんで測定する。

�C　液膜法

　液体試料１〜２滴を２枚の窓板の間にはさみ測定する。液層を厚くする必要がある場合はアルミニウム箔などを２枚の窓板の間にはさみ、その中に液体試料がたまるようにする。

�D　薄膜法

　試料を薄膜のまま又は各条に規定する方法によつて薄膜とした後、測定する。

�E　気体試料測定法

　試料を排気した５〜１０ｃｍの長さの光路をもつ気体セルに各条に規定する圧力で入れ、測定する。必要に応じて１ｍ以上の光路をもつ長光路セルを用いることができる。

(21)　旋光度測定法

　旋光度測定法は、平面偏光が光学的活性物質又はその溶液を通過するときその偏光面を回転する角度を旋光計で測定する方法である。

　旋光度αｘｔとは、特定の単色光ｘ（波長又は名称で記載する。）を用い、温度ｔﾟで測定したときの旋光度を意味し、右旋性を＋、左旋性を−の記号で示す。

　比旋光度は、次の式で表わす。

　〔α〕ｘｔ＝１００α／ｌｃ

　ｔ：測定時の温度

　α：偏光面を回転した角度

　ｌ：試料溶液の層、すなわち、測定に用いた測定管の長さ（ｍｍ）

操作法

　この測定は、別に規定する場合を除き、温度は２０ﾟ、層長は１００ｍｍ、光線はナトリウムスペクトルのＤ線で行う。

(22)　粗脂肪定量法

　粗脂肪定量法は、試料中の脂肪その他のエーテル可溶性物質を定量する方法である。

　各条に、例えば、２０．０％以下（２ｇ）と規定するものは、本品約２ｇを精密に量り、次の操作法により粗脂肪を定量するとき、その量が本品１ｇにつき２００ｍｇ以下であることを示す。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　試料２〜５ｇを精密に量り、径約２．２ｃｍ、高さ約９ｃｍの円筒ろ紙に入れ、その上に脱脂綿を少量ずつ数回に分け軽く押さえるようにして詰める。これを９５〜１００ﾟの乾燥器中で２時間乾燥し、デシケーター（シリカゲル）で放冷後脂肪秤量びん（あらかじめ９５〜１００ﾟで乾燥し、デシケーターで放冷後重量を測定しておいたもの）を連結したソックスレー脂肪抽出装置に入れ、エーテルで抽出する。１６時間抽出した後、円筒ろ紙を取り去り、脂肪秤量びん中のエーテルを回収する。

　脂肪秤量びんを外して残りのエーテルを揮発させ、９５〜１００ﾟで３時間乾燥し、デシケーターで放冷後、その重量を精密に量る。

(23)　粗繊維定量法

　粗繊維定量法は、試料を１．２５％硫酸、１．２５％水酸化ナトリウム液で順次処理し、セルロースその他の不溶又は難溶性の成分を定量する方法である。

　各条に、例えば、５．０％以下（２ｇ）と規定するものは、本品約２ｇを精密に量り、次の操作法により粗繊維を定量するとき、その量が本品１ｇにつき５０ｍｇ以下であることを示す。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。試料２〜５ｇを精密に量り、５００ｍＬのトールビーカーに入れ、５％硫酸溶液５０ｍＬを加え、更に水を加えて２００ｍＬとし、静置した液面に沿つてトールビーカーの外壁に標線を付しておく。次にトールビーカーを時計ざら又は冷却器で覆い、３０分間激しく煮沸する。その間蒸発する水分は常時熱水を補つて硫酸の濃度を１．２５％に保つ。３０分経過後、酸不溶解物を０．０４４ｍｍのステンレス金網（３２５号のふるい又はこれに相当するもの）でろ過し、酸性を呈しなくなるまで熱水で洗浄する。

　酸不溶解物を水１３０〜１４０ｍＬで元のトールビーカーに移し、５％水酸化ナトリウム液５０ｍＬを加え、標線まで水を加えて２００ｍＬとし、時計ざら又は冷却器で覆い３０分間激しく煮沸した後、ろ紙（あらかじめ秤量ざらに入れ、１３５±２ﾟで２時間乾燥し、デシケーター（シリカゲル）で放冷後重量を測定しておいたもの）でろ過し、ろ液がアルカル性を呈しなくなるまで熱水で洗浄し、アルコール、エーテルの順にそれぞれ３〜４回洗浄した後３〜４時間風乾する。

　次に、この酸・アルカリ不溶解物をろ紙と共に前の秤量ざらに移し、１３５±２ﾟで２時間乾燥し、デシケーターで放冷後その重量を精密に量る。

　次に、これをるつぼ（あらかじめ強熱し、デシケーターで放冷後重量を測定しておいたもの）に入れ、穏やかに加熱して炭化させた後、５５０〜６００ﾟで２時間灰化し、デシケーターで放冷後その重量を精密に量つて粗灰分の量を求める。酸・アルカリ不溶解物の量から粗灰分の量を控除し、粗繊維の量とする。

(24)　窒素定量法

　窒素定量法は、窒素を含む有機化合物を硫酸で分解し、硫酸アンモニウムとし、そのアンモニアを定量する方法である。

　各条に、例えば、５．０〜７．０％（ケルダール法）と規定するものは、本品の窒素約２０〜３０ｍｇに対応する量を精密に量り、次のケルダール法により窒素を定量するとき、その量が本品１ｇにつき５０〜７０ｍｇであることを示す。

ケルダール法

装置

　図に示すものを用いる。総硬質ガラス製で、接続部はすり合わせにすることができる。装置に用いるゴムはすべて１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液中で１０〜３０分間煮沸し、次に水中で３０〜６０分間煮沸し、最後に水でよく洗つてから用いる。

　図　（略）

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　窒素（Ｎ）２０〜３０ｍｇに対応する量の試料を精密に量り、ケルダールフラスコＡに入れ、これに硫酸カリウムの粉末５ｇ、硫酸銅０．５ｇ及び硫酸２０ｍＬを加える。次にフラスコを約４５ﾟに傾け、あわ立ちがほとんど止むまで静かに加熱し、更に温度を上げて沸騰させ、内容物が青色の透明な液となつた後更に１〜２時間加熱する。

　冷後、水適量を徐々に加えて放冷した後、あらかじめ水蒸気を通じて洗つた蒸留装置にフラスコを連結する。

　受器Ｊには、ホウ酸溶液（１→２５）２０ｍＬ及びブロムクレゾールグリン・メチルレッド試液３滴を入れ、適量の水を加え、冷却器Ｈの下端をこの液に浸す。次に漏斗Ｃから水酸化ナトリウム溶液（２→５）８５ｍＬを徐々に加え、更に少量の水で洗い込み、Ｄの部分のピンチコックを閉じ、ケルダールフラスコを軽く揺り動かして内容物を混和した後、水蒸気を通じて留液約１２０ｍＬを得るまで蒸留する。次に、冷却器の下端を受器の液面から離し、更にしばらく蒸留を続けた後、冷却器の下端を少量の水で洗い込み、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸で滴定する。この場合において、滴定の終点は、液の緑色が微灰色を経て微灰赤紫色に変るときとする。

　同様の方法で空試験を行い補正する。

　０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸１ｍＬ＝１．４００７ｍｇＮ

セミミクロケルダール法

装置

　図に示すものを用いる。総硬質ガラス製で、接続部はすり合わせにすることができる。装置に用いるゴムはすべて１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液中で１０〜３０分間煮沸し、次に水中で３０〜６０分間煮沸し、最後に水でよく洗つてから用いる。

　図　（略）

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　窒素（Ｎ：１４．００７）２〜３ｍｇに対応する量の試料を精密に量り、又はピペットで正確に量り、ケルダールフラスコＡに入れ、これに硫酸カリウム１０ｇ及び硫酸銅１ｇの混合物を粉末とし、その１ｇを加え、フラスコの首に付着した試料を少量の水で洗い込み、さらにフラスコの内壁に沿つて硫酸７ｍＬを加える。

　次に、フラスコを振り動かしながら、強過酸化水素水１ｍＬを少量ずつ内壁に沿つて注意して加える。フラスコを加熱し、液が青色澄明となり、フラスコの内壁に炭化物を認めなくなつたとき、加熱をやめる。必要ならば冷却した後、強過酸化水素水少量を追加し、再び加熱する。冷後、水２０ｍＬを注意しながら加えて冷却する。フラスコを、あらかじめ水蒸気を通じて洗つた蒸留装置に連結する。受器Ｋにはホウ酸溶液（１→２５）１５ｍＬ及びブロムクレゾールグリン・メチルレッド試液３滴を入れ、適量の水を加え、冷却器Ｊの下端をこの液に浸す。漏斗Ｆから水酸化ナトリウム溶液（２→５）３０ｍＬを加え、注意して水１０ｍＬで洗い込み、直ちにピンチコック付ゴム管Ｇのピンチコックを閉じ、水蒸気を通じて留液８０〜１００ｍＬを得るまで蒸留する。冷却器Ｊの下端を液面から離し、少量の水でその部分を洗い込み、０．００５ｍｏｌ／Ｌ硫酸で滴定する。この場合において、滴定の終点は、液の緑色が微灰青色を経て微灰赤紫色に変わるときとする。

　同様の方法で空試験を行い補正する。

　０．００５ｍｏｌ／Ｌ硫酸１ｍＬ＝０．１４００７ｍｇＮ

(25)　定性反応

　定性反応は、試料の確認試験に用い、通例、その液２〜５ｍＬをとり試験を行う。

亜鉛塩

アルミニウム塩

アンモニウム塩

　アンモニウム塩に過量の１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム試液を加えて加温するとき、アンモニアのにおいを発し、このガスは潤した赤色リトマス紙を青変する。

塩化物

カリウム塩

カルシウム塩

�@　カルシウム塩につき、炎色反応を行うとき、黄赤色を呈する。

クエン酸塩

コハク酸塩

　コハク酸塩の溶液のｐＨを６〜７に調整し、この液に塩化第二鉄試液１ｍＬを加えるとき、褐色の沈殿を生じる。

酢酸塩

酒石酸塩

硝酸塩

�A　硝酸塩の溶液にジフェニルアミン試液を加えるとき、液は青色を呈する。

炭酸塩

炭酸水素塩

鉄塩、第一

鉄塩、第二

銅塩、第二

ナトリウム塩

�@　ナトリウム塩につき、炎色反応を行うとき、黄色を呈する。

乳酸塩

　乳酸塩の硫酸酸性溶液に過マンガン酸カリウム試液を加えて加熱するとき、アセトアルデヒドのにおいを発する。

芳香族アミン、第一

　芳香族第一アミンの酸性溶液に氷冷しながら亜硝酸ナトリウム試液３滴を加えて振り混ぜ、２分間放置し、次にスルファミン酸アンモニウム試液１ｍＬを加えてよく振り混ぜ、１分間放置した後、シュウ酸Ｎ−（１−ナフチル）−Ｎ′−ジエチルエチレンジアミン試液１ｍＬを加えるとき、液は赤紫色を呈する。

マグネシウム塩

マンガン塩

ヨウ化物

硫酸塩

リン酸塩（正リン酸塩）

(26)　鉛試験法（ジチゾン法）

　鉛試験法は、試料中に混在する鉛の量を試験する方法である。

試液・標準液

操作法

　各条に規定する量の検液及び本品を用いないで検液の場合と同様に操作して得た空試験液をとり、クエン酸アンモニウム溶液２ｍＬ及びメチルレッド試液２滴を加え、液が黄色を呈するまで強アンモニア水を滴加し、さらに水を加えて全量を約１００ｍＬとする。これにシアン化カリウム溶液１０ｍＬ及び亜硫酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加えてよく振り混ぜ、水浴上で１０〜１５分間加熱する。冷後、強アンモニア水１．５ｍＬを加えた後、分液漏斗に移し、ジチゾン・ベンゼン溶液１０ｍＬを正確に加え、１分間強く振り混ぜて水層を除く。さらに希シアン化カリウム溶液４０ｍＬを加え、３０秒間強く振り混ぜて放置した後、ベンゼン層を分取し、ベンゼンを対照として、層長１０ｍｍで５２５ｎｍ付近における吸収の極大波長で吸光度Ａ_Ｔ及びＡ_Ｂを測定する。同時にジチゾン用鉛標準液１０ｍＬ及び水１０ｍＬについて、検液と同様に操作し、吸光度Ａ_Ｓ及びＡ_０を測定する。

　鉛（Ｐｂ）の量（ｐｐｍ）＝１０×（（Ａ_Ｔ−Ａ_Ｂ）／（Ａ_Ｓ−Ａ_０））×（検液全量（ｍＬ）／検液採取量（ｍＬ））×（１／試料の量（ｇ））

　注意：試験に用いる試薬及び試液は鉛を含まず、又はほとんど含まないものを用いる。また、ガラス器具はあらかじめ薄めた塩酸（１→２）でよく洗い、さらに水で洗つたものを用いる。

(27)　バイオオートグラフ法

　バイオオートグラフ法は、ろ紙クロマトグラフ法又は薄層クロマトグラフ法を応用して分離した混合物中の力価を有する成分を生物学的方法によつて、確認又はそのおおよその量を測定する方法である。

操作法

　ろ紙、薄層板、培養箱の形状、展開溶媒、常用標準希釈液、試料液、培地、試験菌液（又は試験胞子液）の調製、Ｒｆ値、移動距離、測定値、計算及び判定は、各条に規定する。

　滅菌した培養箱に培地及び試験菌液（又は試験胞子液）を加えて平板を作成する。これらの操作はできる限り無菌的に行う。

　ろ紙又は薄層板の原線を等間隔に４等分し、４区画になるよう垂直線を引く。各区画の原線の中央を原点とし、第１の区画から第３の区画の各原点ごとに、各常用標準希釈液の高濃度のものから、順次５μＬずつ、第４の区画の原点には試料液５μＬを、それぞれ正確にマイクロピペットを用いて点滴し、しみこませた後、風乾する。

　このろ紙又は薄層板を、必要あれば展開溶媒の気体で飽和した装置の中で３０〜６０分間放置した後、展開溶媒を下降又は上昇させる。温度は２０〜３０ﾟで行う。溶媒の下達線又は上達線が、ろ紙又は薄層板の下端又は上端より１０〜３０ｍｍに達したとき、展開をやめ、ろ紙又は薄層板をとり出し、室温で放置し、溶媒を乾燥除去する。乾燥後ろ紙又は薄層板を区画線に沿つて４等分し、必要があれば不要部分を切り捨て、培養箱の培地上に、４切片のろ紙又は薄層板をそれぞれ約１５ｍｍの間隔で並べる。この際、ろ紙又は薄層板の各部と培地とは完全に接着するように注意して並べる。５〜１５分間接触させた後、ろ紙又は薄層板をとり去る。これらの操作は雑菌が入らぬよう注意して行う。培養箱は３２〜３７ﾟで１７〜２０時間培養する。

(28)　薄層クロマトグラフ法

　薄層クロマトグラフ法は、適当な固定相で作られた薄層を用い、混合物を移動相で展開させてそれぞれの成分に分離する方法であり、物質の確認又は純度の試験等に用いる。

薄層板の調製

　通例、次の方法による。

　薄層板は５０ｍｍ×２００ｍｍ又は２００ｍｍ×２００ｍｍの平滑で均一な厚さのガラス板に適当な器具を用いて、各条に規定する固定相固体の粉末を水で懸濁し、０．２〜０．３ｍｍの均一な厚さに塗布する。風乾後、１０５〜１２０ﾟの間の一定温度で３０〜６０分間加熱、乾燥して調製する。ガラス板の代わりに適当なプラスチック板を使うことができる。薄層板は湿気を避けて保存する。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　薄層板の下端から約２０ｍｍの高さを原線とし、両側から少なくとも１０ｍｍ離し、原線上に各条に規定する量の試料溶液及び標準溶液を、マイクロピペットを用いて約１０ｍｍの間隔でスポットし、風乾する。次にこの薄層板を展開用容器に入れて密閉し、常温で展開を行う。展開用容器にはあらかじめ展開溶媒を１０ｍｍの深さに入れ、展開溶媒の蒸気で飽和しておく。

　展開溶媒の先端が原線から各条に規定する距離まで上昇したとき、薄層板をとり出し、風乾した後、各条に規定する方法によつて、それぞれのスポットの位置及び色等を調べる。Ｒｆ値は次の式によつて求める。

　Ｒｆ＝原線からスポットの中心までの距離／原線から溶媒先端までの距離

(29)　ｐＨ測定法

　ｐＨを測定するには、ガラス電極によるｐＨ計を用いる。

　ｐＨは、次の式で定義される値である。この値は、厳密な意味での物理化学的な意義をもつものではないが、試料の水溶液中の水素イオン濃度を、その逆数の常用対数で示した値とかなりよく一致する。

　ｐＨ＝ｐＨ_Ｓ＋（Ｅ−Ｅ_Ｓ）／α

　ｐＨ_Ｓ：ｐＨ標準液のｐＨ値

　Ｅ：試料溶液中でガラス電極と比較電極を組み合わせた電池の起電力

　Ｅ_Ｓ：ｐＨ標準液中でガラス電極と比較電極を組み合わせた電池の起電力

　α＝（２．３０２６×ＲＴ）／Ｆ

　Ｒ：気体定数

　Ｔ：絶対温度

　Ｆ：ファラデー定数

装置

　ｐＨ計は、通例、ガラス電極及び比較電極からなる検出部と、検出されたｐＨを指示する指示部からなる。指示部には、非対称電位調整用つまみ及び温度補償用つまみがある。温度補償用つまみのないものには、温度補償用感温部がある。

　ｐＨ計は、次の操作法にしたがい、任意の一種類のｐＨ標準液のｐＨを毎回検出部を水でよく洗つた後、５回繰り返し測定するとき、その再現性が±０．０５以内のものを用いる。

操作法

　ガラス電極は、あらかじめ水に数時間以上浸しておく。ｐＨ計は電源を入れ、５分間以上たつてから使用する。検出部はよく水で洗い、付着した水はろ紙等で軽くふきとる。温度補償用つまみのあるものは、そのつまみをｐＨ標準液の温度と一致させ、検出部を試料溶液のｐＨ値に近いｐＨ標準液中に浸し、２分間以上たつてからｐＨ計の指示が、その温度におけるｐＨ標準液のｐＨになるように調整する。２点で調整する場合は、通例、リン酸塩ｐＨ標準液と、試料溶液のｐＨ値に近いｐＨ標準液を用いて前記に準じて操作する。次に検出部をよく水で洗い、付着した水はろ紙などで軽くふきとつた後、試料溶液に浸し測定値を読みとる。

(30)　比重測定法

　比重とは、物質の質量とそれと等体積の標準物質の質量の比をいう。

　比重ｄ_ｔ^ｔ’とは、試料と水（Ｈ_２Ｏ）とのそれぞれ温度ｔ′ﾟ及びｔﾟにおける等体積の重量の比をいう。別に規定する場合を除き、測定には第１法又は第２法を用い、数値に「約」を付記してあるときは第３法を用いることができる。

操作法

�@　第１法　比重びんによる測定法

　比重びんは、通例、内容１０〜１００ｍＬのガラス製容器で、温度計付きのすり合わせのせんと標線及びすり合わせのふたのある側管とがある。あらかじめ清浄にし、乾燥した比重びんの重量Ｗを量る。次にせん及びふたを除き、試料をみたして規定温度ｔ′ﾟより１〜３ﾟ低くし、あわが残らないように注意してせんをする。徐々に温度を上げ、温度計が規定温度を示したとき、標線の上部の試料を側管から除き、側管にふたをし、外部をよくふいた後、重量Ｗ_１を量る。同じ比重びんで水を用いて同様に操作し、その規定温度ｔﾟにおけるＷ_２を量る。

　ｄ_ｔ^ｔ’＝（Ｗ_１−Ｗ）／（Ｗ_２−Ｗ）

�A　第２法　シュプレンゲル・オストワルドピクノメーターによる測定法

　シュプレンゲル・オストワルドピクノメーターは、通例、内容１〜１０ｍＬのガラス製容器で、図のように両端は肉厚細管（内径１〜１．５ｍｍ、外径３〜４ｍｍ）となつており、一方の細管Ａには標線Ｃがある。あらかじめ清浄にし、乾燥したピクノメーターを白金又はアルミニウム等の線Ｄで化学はかりの腕のかぎにかけて重量Ｗを量る。次に規定温度より３〜５ﾟ低い試料中に細管Ｂを浸す。Ａにはゴム管又はすり合わせの細管を付け、あわが入らないように注意し、試料をＣの上まで吸い上げる。次に規定温度ｔ′の水浴中に約１５分間浸した後、Ｂのはしにろ紙片をあて、試料の先端をＣに一致させる。水浴からとりだし、外部をよくふいた後重量Ｗ_１を量る。同じピクノメーターで水を用いて同様に操作し、その規定温度ｔﾟにおける重量Ｗ_２を量る。第１法の式によつて比重ｄ_ｔ^ｔ’を計算する。

　図　（略）

�B　第３法　浮きばかりによる測定法

　浮きばかりをエタノール又はエーテルで清浄にした後、試料をガラス棒でよくかき混ぜ浮きばかりを入れ、それに規定された温度にし、静止したとき、メニスカスの上線で比重を読む。ただし、読み方が表示してある浮きばかりでは、その方法に従う。

(31)　ヒ素試験法

　ヒ素試験法は、試料中に混在するヒ素の限度試験である。その限度は三酸化ヒ素（ＡＳ_２Ｏ_３）の量として表わす。

　各条には、ヒ素（ＡＳ_２Ｏ_３としての）限度をｐｐｍで（　　）内に付記する。

装置

　図に示すものを用いる。

　図　（略）

　排気管Ｂに約３０ｍｍの高さにガラス繊維Ｆを詰め、酢酸鉛試液及び水の等容量混液で均等に潤した後、下端から弱く吸引して、過量の液を除く。これをゴムせんＨの中心に垂直にさし込み、Ｂの下部の小孔Ｅは下にわずかに突き出るようにして発生びんＡに付ける。Ｂの上端にはガラス管Ｃを垂直に固定したゴムせんＪを付ける。Ｃの下端はＪの下端と同一平面とする。次に、使用直前にＣ及びＤのすり合わせ面の間に臭化第二水銀紙ＧをはさみクリップＫでＣ及びＤを固定する。

操作法

　検液の調製は、別に規定する場合を除き、次の方法による。

�@　第１法

　各条に規定する量の試料を量り、水５ｍＬを加え、必要ならば加温して溶かし、検液とする。

�A　第２法

　各条に規定する量の試料を量り、水５ｍＬ及び硫酸１ｍＬを加える。ただし、無機酸の場合には硫酸を加えない。これに亜硫酸水１０ｍＬを加え、小ビーカーに入れ、水浴上で加熱して亜硫酸がなくなり約２ｍＬとなるまで蒸発し、水を加えて５ｍＬとし、検液とする。

�B　第３法

　各条に規定する量の試料を量り、白金製、石英製又は磁性のるつぼにとる。これに硝酸マグネシウムのエタノール溶液（１→５０）１０ｍＬを加え、エタノールに点火して燃焼させた後、徐々に加熱して灰化する。この方法で、なお炭化物が残るときは、少量の硝酸で潤し、再び強熱して灰化する。冷後、残留物に塩酸３ｍＬを加え、水浴上で加温して溶かし、検液とする。

　検液の試験は、別に規定する場合を除き、次の方法による。

　発生びんＡに検液をとり、必要ならば少量の水で洗い込む。これにメチルオレンジ試液１滴を加え、アンモニア試液、強アンモニア水又は希塩酸を用いて中和した後、薄めた塩酸（１→２）５ｍＬ及びヨウ化カリウム試液５ｍＬを加え、２〜３分間放置した後、さらに酸性塩化第一スズ試液５ｍＬを加え、室温で１０分間放置する。次に水を加えて４０ｍＬとし、無ヒ素亜鉛２ｇを加え、直ちにＢ、Ｃ、Ｇ及びＤを連結してゴムせんＨを発生びんＡに付け、２５ﾟの水中に発生びんＡの肩まで浸し、１時間放置した後、直ちに臭化第二水銀紙の色を観察する。この色は標準色より濃くてはならない。

　なお、標準色の調製は同時に行う。

標準色の調製

　発生びんＡにヒ素標準液２ｍＬを正確に加え、さらに薄めた塩酸（１→２）５ｍＬ及びヨウ化カリウム試液５ｍＬを加えて２〜３分間放置した後、酸性塩化第一スズ試液５ｍＬを加え、室温で１０分間放置する。以下前記と同様に操作して得た臭化第二水銀紙の呈色を標準色とする。この色は三酸化ヒ素（ＡＳ_２Ｏ_３）０．００２ｍｇに対応する。

ヒ素標準原液：三酸化ヒ素を微細の粉末とし、１０５ﾟで４時間乾燥し、その１００ｍｇを正確に量り、水酸化ナトリウム溶液（１→５）５ｍＬを加えて溶かす。この液に希硫酸を加えて中性とし、さらに希硫酸を追加し、新たに煮沸し冷却した水を加えて正確に１，０００ｍＬとする。ヒ素標準液：ヒ素標準原液１０ｍＬを正確に量り、希硫酸１０ｍＬを加え、新たに煮沸し冷却した水を加えて正確に１，０００ｍＬとする。この液１ｍＬは三酸化ヒ素（Ａｓ２Ｏ３）０．００１ｍｇを含む。この液は用時調製し、共せんびんに保存する。

　注意：試験に用いる器具、試薬及び試液はヒ素を含まず、又はほとんど含まないものを用い、必要ならば空試験を行う。

(32)　ビタミンＡ定量法

　ビタミンＡ定量法は、「ビタミンＡ油」、「ビタミンＡ粉末」その他の飼料添加物中のビタミンＡを紫外部の吸光度測定によつて定量する方法である。この場合において、定量を妨害する物質の存在するときは、適当な前処理を行う必要がある。

　１ビタミンＡ単位（１ビタミンＡ国際単位と同じ。）は、ビタミンＡ（アルコール型）０．３μｇに相当する。

試薬

操作法

　操作は速やかに行い、できるだけ空気又は他の酸化剤との接触を避け、容器はしや光容器を用いる。

　各条で別に規定する場合を除き、第１法を用いるが、第１法で測定できる条件に適合しないものには第２法を用いる。

�@　第１法

　試料約０．５ｇを精密に量り、イソプロパノールを加えて溶かし、正確に２５０ｍＬとする。この液を層長１０ｍｍで３２６ｎｍにおける吸光度が約０．５となるようにイソプロパノールで正確にうすめて試料溶液とし、吸収極大の波長を測定する。また、層長１０ｍｍで３００ｎｍ、３１０ｎｍ、３２０ｎｍ、３２６ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍ及び３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、３２６ｎｍの吸光度を１．０００としたときの各波長における吸光度の比を求める。吸収極大の波長が３２５〜３２８ｎｍの間にあり、かつ、得られた各波長における吸光度の比が、それぞれ表の値の±０．０３０の範囲内にあれば、３２６ｎｍの吸光度Ａから試料１ｇ中のビタミンＡ単位を算出する。

　１ｇ中のビタミンＡ単位数＝Ｅ^１％_１ｃｍ（３２６ｎｍ）×１，９００

　Ｅ^１％_１ｃｍ（３２６ｎｍ）＝（Ａ／Ｗ）×（Ｖ／１００）

　Ｖ：試料溶液の総ｍＬ数

　Ｗ：試料溶液ＶｍＬ中の試料のｇ数

　酢酸レチノール及びパルミチン酸レチノールの確認には次の確認試験を行う。

　試料、薄層クロマトグラフ用酢酸レチノール標準品及び薄層クロマトグラフ用パルミチン酸レチノール標準品それぞれ１５，０００ビタミンＡ単位に相当する量をとり、それぞれ石油エーテル５ｍＬに溶かし、試料溶液及び標準溶液とする。この液につき薄層クロマトグラフ法によつて試験を行う。試料溶液及び標準溶液５μＬずつを薄層クロマトグラフ用シリカゲルを用いて調製した薄層板にスポットする。次にベンゼンを展開溶媒として約１０ｃｍ展開した後、薄層板を風乾する。これに三塩化アンチモン試液を噴霧し、試料及び標準品の青色に呈色した主なスポットの位置を比較して確認する。

　第１法によつて操作し、もし吸収極大の波長が３２５〜３２８ｎｍの間にないとき又は吸光度の比が表示した値の±０．０３０の範囲内にないときには第２法を用いる。

λ（ｎｍ）	酢酸レチノール	パルミチン酸レチノール
３００ ３１０ ３２０ ３２６ ３３０ ３４０ ３５０	０．５７８ ０．８１５ ０．９４８ １．０００ ０．９７２ ０．７８６ ０．５２３	０．５９０ ０．８２５ ０．９５０ １．０００ ０．９８１ ０．７９５ ０．５２７

　

�A　第２法

　別に規定する場合を除き、５００ビタミンＡ単位以上に相当し、油脂１ｇ以下を含む試料を精密に量り、フラスコに入れ、無アルデヒドエタノール３０ｍＬ及びピロガロールのエタノール溶液（１→１０）１ｍＬを加える。次に水酸化カリウム溶液（９→１０）３ｍＬを加え、還流冷却器を付け、水浴上で３０分間加熱し、けん化する。速やかに常温まで冷却し、水３０ｍＬを加え、分液漏斗Ａに移し、フラスコは水１０ｍＬで洗つた後エーテル４０ｍＬで洗い、洗液を分液漏斗Ａに入れ、よく振り混ぜて放置する。水層を分液漏斗Ｂに分取し、エーテル３０ｍＬでフラスコを洗つた後、洗液を分液漏斗Ｂに入れ、振り混ぜて抽出する。水層はフラスコに分取し、エーテル層は分液漏斗Ａに合わせ、分取した水層は分液漏斗Ｂに入れ、エーテル３０ｍＬを加え、振り混ぜて抽出する。エーテル層は分液漏斗Ａに合わせる。これに水１０ｍＬを加え、静かに２〜３回倒立した後静置し、分離した水層を除く。さらに水５０ｍＬずつで３回洗い、回の進むにつれて次第に強く振る。さらに洗液がフェノールフタレイン試液で呈色しなくなるまで、水５０ｍＬずつで洗つた後、１０分間放置する。水をできるだけ除き、エーテル抽出液を三角フラスコに移し、エーテル１０ｍＬずつで２回洗い込む。次に無水硫酸ナトリウム５ｇを加えて振り混ぜた後、傾斜してエーテル抽出液をナス型フラスコに移す。残つた硫酸ナトリウムはエーテル１０ｍＬずつで２回以上洗い、洗液をフラスコに合わせる。エーテル抽出液を４５ﾟの水浴中で振り動かしながら、アスピレーターを用い濃縮して約１ｍＬとし、直ちにイソプロパノールを加えて溶かし、１ｍＬ中に６〜１０ビタミンＡ単位を含むように正確に薄め試料溶液とする。この液につき層長１０ｍｍで波長３１０ｎｍ、３２５ｎｍ及び３３４ｎｍにおける吸光度Ａ_１、Ａ_２及びＡ_３を測定する。

　１ｇ中のビタミンＡ単位数＝Ｅ^１％_１ｃｍ（３２５ｎｍ）×１，８３０

　Ｅ^１％_１ｃｍ（３２５ｎｍ）＝（Ａ_２／Ｗ）×（Ｖ／１００）×ｆ

　ｆ＝６．８１５−２．５５５×（Ａ_１／Ａ_２）−４．２６０×（Ａ_３／Ａ_２）

　ｆ：補正係数

　Ｖ：試料溶液の総ｍＬ数

　Ｗ：試料溶液ＶｍＬ中の試料のｇ数

(33)　ビタミンＤ定量法

　ビタミンＤ定量法は、「ビタミンＤ_３油」、「ビタミンＤ粉末」その他の飼料添加物中のビタミンＤをガスクロマトグラフ法によつて定量する方法である。ただし、この定量法はビタミンＤに対するビタミンＥ（酢酸ｄｌ−α−トコフェロール）の重量比が２，５００以下のものに適用される。

　ビタミンＤ粉末製剤にあつては、８，０００ビタミンＤ国際単位に対応する量を精密に量り、アスコルビン酸ナトリウム溶液（１→２０）２０ｍＬを加え還流冷却器を付け、水浴中で泥状又は乳状とした後、これを試料として試験を行う。

　ステロールが混在している場合にあつては、ケイソウ土・ジギトニンカラムによる脱ステリン操作を加える。試料をけん化抽出したベンゼン層５０ｍＬを減圧留去して得られた残留物に、ｎ−ヘキサン３ｍＬを加えて溶かしたものを、ケイソウ土・ジギトニンカラムに加えた後、ｎ−ヘキサンを追加して０．５ｍＬ/ｍｉｎの流速で流下させ、溶出液約３０ｍＬを集める。この溶出液の溶媒を留去した後、残留物にアセトン１．０ｍＬを正確に加えて溶かし、以下薄層クロマトグラフ用試料溶液として試験を行う。

　１ビタミンＤ国際単位は、ビタミンＤ_３０．０２５μｇに相当する。

試薬・試液

　本法の試薬は、上記以外のものにあつては、日本工業規格試薬の特級の規格に適合するものを用いる。

標準品・標準溶液

ケイソウ土・ジギトニンカラムの調製

　ジギトニン６００ｍｇに水１０ｍＬを加え、加温溶解し、約１時間放置した後、その５ｍＬをとり、クロマトグラフ用ケイソウ土１０ｇに加え、均等に混和し、その３ｇをとり、ｎ−ヘキサンとともに１０×３００ｍｍのかつ色ガラス管に流し込み、大部分のｎ−ヘキサンを流出し、ケイソウ土・ジギトニンカラムを調製する。

操作法

　操作は速やかに行い、容器はしや光容器を用いる。

　８，０００ビタミンＤ国際単位に対応する試料を精密に量り、フラスコに入れ、無アルデヒド・エタノール５０ｍＬ及びピロガロールのエタノール溶液（２→１０）２０ｍＬを加える。次に水酸化カリウム溶液（９→１０）８ｍＬを加え、還流冷却器を付け、水浴上で３０分間加熱し、けん化する。速やかに常温まで冷却し、ベンゼン１００ｍＬを正確に加えてせんをし、よく振り混ぜた後、分液漏斗に移し、これに水酸化カリウム試液４０ｍＬを加えて１５秒間激しく振り混ぜた後、静置し、水層を除く。

　ベンゼン層に水酸化カリウム溶液（３→１００）４０ｍＬを加えて振り混ぜた後、静置し、水層を除く。これに水４０ｍＬを加え、静かに２〜３回倒立した後、静置し、水層を除く。さらに水４０ｍＬずつで洗い、回の進むにつれて次第に強く振る。洗液がフェノールフタレイン試液で呈色しなくなるまで洗つた後、水をできるだけ除く。次いで乾燥した円形のろ紙（直径９ｃｍ）に切り込みを入れたものを加え、ベンゼン層が澄明になるまで振り混ぜる。

　ベンゼン層５０ｍＬを正確に量り、ガラスせん付１００ｍＬのナス型フラスコに入れ、４０ﾟの水浴中で振り動かしながらアスピレーターを用い減圧留去する。残留物にアセトン１．０ｍＬを正確に加え、せんをしてよく振り混ぜて溶かし、薄層クロマトグラフ用試料溶液とする。この試料溶液０．２ｍＬを正確に量り、薄層クロマトグラフ用シリカゲル（けい光剤入り）を用いて調製した薄層板にスポットする。別にビタミンＤ・プレＤ溶液を同一の薄層板のすみにスポットする。次にｎ−ヘキサン・酢酸エチル混液（４：１）を展開溶媒として約１５ｃｍ展開した後、薄層板を風乾し、紫外線（主波長２５４ｎｍ）を照射し、薄層クロマトグラフ用試料溶液から得たビタミンＤ及びプレＤの部分をステンレス製ミクロスパーテルで５分以内にかきとり、５０ｍＬのビーカーに入れる。

　アセトン５ｍＬずつで６回抽出し、ろ紙を用いて５０ｍＬの丸底フラスコ中にろ過する。ろ紙は少量のアセトンで洗い、洗液をろ液に合わせる。アセトン抽出液を４０ﾟの水浴中で振り動かしながらアスピレーターを用い減圧留去する。速やかに室温にもどし、残留物に内部標準溶液Ｂ液０．５０ｍＬを正確に加えて溶かし試料溶液とする。

　試料溶液及びビタミンＤ標準溶液につき、次の条件でガスクロマトグラフ法によつて試験を行い、半値幅法によつてピロＤ及び酢酸スチグマステロールそれぞれのピーク面積を求め、その面積比を求める。

　試料１ｇ中のビタミンＤの国際単位数＝Ｓ×（試料溶液の内部標準物質に対するピロＤのピーク面積比／標準溶液の内部標準物質に対するピロＤのピーク面積比）×Ｖ×（１／Ｗ）

　なお、操作条件は、次のとおりとする。

　検出器：水素炎イオン化検出器

　温度：分離管２２５ﾟ　試料注入口２５０ﾟ　検出器３００ﾟ

　注入量：５μＬ

(34)　沸点測定法及び蒸留試験法

　沸点の測定及び蒸留試験は、別に規定する場合を除き、次の第１法又は第２法による。沸点は、最初の留液５滴が冷却器の先端から留出したときから、最後の液がフラスコの底部から蒸発するときまでの温度とする。また、蒸留試験は、各条に規定する温度範囲の留分の容量を量るものである。

第１法　各条に規定する温度範囲が５ﾟ未満のとき用いる。

装置

　図に示すものを用いる。

　図　（略）

操作法

　あらかじめ液温を測定した試料２５ｍＬを０．１ｍＬの目盛りのあるメスシリンダーＧを用いて量り、内容５０〜６０ｍＬの蒸留フラスコＡに入れ、このメスシリンダーを洗わずに受器とし、Ａに沸騰石を入れ、浸線付温度計Ｂは浸線ＣがコルクせんＤの下端にくるように、また水銀球の上端が留出口の中央部にくるように付け、Ａに冷却器Ｅを連結し、ＥにはアダプターＦを接続し、Ｆの先端は受器のメスシリンダーＧの口にわずかに空気が流通するようにして差し込む。Ａをおおう高さの風よけを付け、適当な熱源を用いてＡを加熱する。

　別に規定するもののほか、測定温度２００ﾟ未満のものは１分間４〜５ｍＬ、２００ﾟ以上のものは１分間３〜４ｍＬの留出速度で蒸留し、留液の温度を初めの試料の液温と等しくし、留分の容量を量る。

　８０ﾟ以下で蒸留し始める液では、あらかじめ試料を１０〜１５ﾟに冷却してその容量を量り、蒸留中はメスシリンダーの上部から２５ｍｍ以下を氷冷する。

　気圧に対する温度の補正は０．３６ｋＰａにつき０．１ﾟとし、気圧１００ｋＰａ未満のときこれを加え、１００ｋＰａを超えるときはこれを減じる。

第２法　各条に規定する温度範囲が５ﾟ以上のとき用いる。

装置

　第１法と同様の装置を用いる。ただし、蒸留フラスコＡは内容２００ｍＬ、首の内径１８〜２４ｍｍで内径５〜６ｍｍの留出管がついているものを用いる。

操作法

　あらかじめ液温を測定した試料１００ｍＬを１ｍＬの目盛りのあるメスシリンダーを用いて量り、第１法と同様に操作する。

(35)　融点測定法

　融点とは、次のそれぞれの方法で測定した温度をいう。ある物質の融点が範囲で示されているときには、その物質の融点がその範囲内にあればよいことを示す。

　その測定法は飼料添加物の性状によつて次の２方法に分ける。別に規定する場合を除き、第１法を用いる。

操作法

�@　第１法

　粉末にしやすいものは、この方法による。

　試料を微細の粉末とし、別に規定する場合を除き、デシケーター（シリカゲル）で２４時間乾燥する。また、乾燥後とあるときは、乾燥減量の項の条件で乾燥したものを用いる。この試料を乾燥した毛細管Ｈに入れ、時計ざらの上に立てた長さ約７００ｍｍのガラス管の内部に落とし、はずませて固くつめ、層の厚さが２．５から３．５ｍｍとなるようにする。

　溶液Ｂを加熱して予想した融点の約１０ﾟ下の温度まで徐々に上げ、浸線付温度計Ｄの浸線を溶液のメニスカスに合わせ、試料を入れた毛細管ＨをコイルスプリングＧにそう入し試料をつめた部分がＤの水銀球の中央にくるようにする。次に１分間に約３ﾟ上昇するように加熱して温度を上げ、予想した融点より約５ﾟ低い温度から１分間に１ﾟ上昇するように加熱を続ける。

　試料がＨ内で液化して、固体を全く認めなくなつたときのＤの示度を読み取り、融点とする。

　なお、装置は図に示すものを用い、並びに溶液、浸線付温度計及び毛細管は次のものを用いる。

　図　（略）

�A　第２法

　脂肪、脂肪酸、パラフィン又はろうのようなもので、水に不溶性で粉末にしにくいものは、この方法による。

　試料を注意しながらできるだけ低温で融解し、これを、あわが入らないようにして毛細管（第１法のもので両端を開いたもの）中に吸い上げ、約１０ｍｍの高さとする。毛細管から試料が流出しないように保ち、１０ﾟ以下で２４時間放置するか又は少なくとも１時間氷上に放置した後、試料の位置が水銀球の中央外側にくるようにゴム輪で温度計にとり付け、水を入れたビーカーに入れ、試料の下端を水面下３０ｍｍの位置に保つ。水を絶えずかき混ぜながら加温して、予想した融点より５ﾟ低い温度に達したとき、１分間に１ﾟ上昇するように加熱を続ける。毛細管中で試料が浮上するときの温度を融点とする。

(36)　硫酸塩試験法

　硫酸塩試験法は、試料中に混在する硫酸塩の限度試験である。

　各条には、硫酸塩（ＳＯ_４として）の限度を％で（　）内に付記する。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　各条に規定する量の試料をネスラー管にとり、水適量を加えて溶かし、４０ｍＬとする。これに希塩酸１ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとし、検液とする。別に各条で規定する量の０．００５ｍｏｌ／Ｌ硫酸をとり、希塩酸１ｍＬ及び水を加えて５０ｍＬとし、比較液とする。この場合、検液が澄明でないときは、両液を同条件でろ過する。

　検液及び比較液に塩化バリウム試液２ｍＬずつを加えて混和し、１０分間放置した後、黒色の背景を用い、ネスラー管の上方又は側方から観察して混濁を比較する。

　検液の呈する混濁は、比較液の呈する混濁より濃くてはならない。

(37)　硫酸呈色物試験法

　硫酸呈色物試験法は、試料中に含まれる微量の不純物で硫酸によつて容易に着色する物質を試験する方法である。

操作法

　あらかじめネスラー管を硫酸呈色物用硫酸でよく洗う。別に規定する場合を除き、試料が固体の場合にはネスラー管に硫酸呈色物用硫酸５ｍＬを入れ、試料を粉末とし、各条に規定する量を少量ずつ加え、ガラス棒でかき混ぜて完全に溶かす。試料が液体の場合には各条に規定する量をとり、ネスラー管に入れ、硫酸呈色物用硫酸５ｍＬを加えて振り混ぜる。この間、発熱し温度が上昇するものは冷却し、温度の影響のあるものは標準温度に保ち、１５分間放置した後、液を白色の背景を用い、ネスラー管に入れた各条に規定する色の比較液と側方から観察して比色する。

(38)　ろ紙クロマトグラフ法

　ろ紙クロマトグラフ法は、ろ紙を用い、混合物を移動相で展開させてそれぞれの成分に分離する方法であり、物質の確認又は純度の試験等に用いる。

操作法

　別に規定する場合を除き、次の方法による。

　幅２０から３０ｍｍ、長さ４００ｍｍの長方形のろ紙の下端から約５０ｍｍの高さを原線とし、この中央に各条で規定する量の試料溶液を、マイクロピペット又は毛細管を用いてスポットし、風乾する。次に、あらかじめ展開溶媒を入れ、その蒸気で飽和させておいた高さ約５００ｍｍの展開用容器に、このろ紙を入れ、器壁にふれないように注意してつるし、下端から約１０ｍｍまでを、器底の展開溶媒中に浸し、容器を密閉し、常温で展開を行う。

　展開溶媒の先端が原線から各条に規定する距離まで上昇したとき、ろ紙を容器から取り出し、直ちに溶媒の先端の位置に印を付け、風乾した後、各条に規定する方法によつて、スポットの位置及び色等を調べる。Ｒｆ値は次の式によつて求める。

　Ｒｆ＝原線からスポットの中心までの距離／原線から溶媒先端までの距離

(1) 標準品

　標準品は、一定の純度又は一定の生物学的作用を有するように調製された物質で、飼料添加物を生物学的又は理化学的に試験するときに用いるものである。

操作条件

　カラム温度：２５ﾟ付近の一定温度

　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ

乾燥減量　０．５％以下（０．１ｇ，シリカゲル，２４時間）

Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルトリスシクロヘキシルアンモニウムの量（ｍｇ）＝Ａ÷２７９．５×５０，０００

確認試験

純度試験

　本品の水分（％）＝（５０×Ｓ−Ｂ×（Ｗ_２−Ｗ_１）／Ｗ_３）／（Ｗ_１×１０）

　Ｓ：１ｍＬの試料溶液中の水分（ｍｇ）

　Ｗ_１：本品の採取量（ｇ）

　Ｗ_２：試料溶液５０ｍＬの重量（ｇ）

　Ｗ_３：Ｂの測定に用いた約１ｍＬのメタノール・硫酸混液（７０：１）の重量（ｇ）

Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウムの量（ｍｇ）＝Ｗ×（４／５）×（（Ａ_Ｔ１−Ａ_Ｔ２）／Ａ_Ｓ）×（３７９．６１／１３６．０９）×１，０００

　Ｗ：リン酸二水素カリウムの量（ｇ）

４−アセタミド−２−ヒドロキシ安息香酸メチル　Ｃ_１０Ｈ_１１ＮＯ_４

性状　本品は、白色の結晶性の粉末で、においはない。

確認試験

純度試験

�@　融点　本品の融点は、１５１から１５３ﾟでなければならない。

乾燥減量　１．０％以下（１ｇ，１０５ﾟ，２時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

４−アミノ−２−エトキシ安息香酸メチル　Ｃ_１０Ｈ_１３ＮＯ_３

含量　本品は、乾燥した後定量するとき、４−アミノ−２−エトキシ安息香酸メチル（Ｃ_１０Ｈ_１３ＮＯ_３）９８．０％以上を含む。

性状

�@　本品は、灰かつ色の結晶性の粉末で、においはない。

�A　融点　９９から１０１ﾟ（分解）

確認試験

乾燥減量　３．０％以下（１ｇ，シリカゲル，３時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

性状

�@　本品は、白色の結晶性の粉末で、においはない。

�A　融点　約２４８ﾟ（分解）

確認試験

�A　本品の水溶液（１→５０）は、塩化物の定性反応を呈する。

乾燥減量　０．５％以下（１ｇ，減圧，１００ﾟ，３時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

性状　本品は、白色からわずかに微黄白色の結晶性の粉末で、においはない。

純度試験

�@　融点　本品の融点は、１４７から１５１ﾟでなければならない。

乾燥減量　０．５％以下（１ｇ，減圧，１００ﾟ，２時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

塩酸チアミン　Ｃ_１２Ｈ_１７ＣｌＮ_４ＯＳ・ＨＣｌ〔日本薬局方標準品〕

塩酸ピリドキシン　Ｃ_８Ｈ_１１ＮＯ_３・ＨＣｌ〔日本薬局方標準品〕

性状

�B　本品の水溶液（１→２００）のｐＨは、３．５から４．３である。

�C　融点　１１７から１２０ﾟ

確認試験

純度試験

水分　３．７から４．７％（０．５ｇ）

強熱残分　０．１５％以下（１．０ｇ）

シアノコバラミン　Ｃ_６３Ｈ_８８ＣｏＮ_１４Ｏ_１４Ｐ〔日本薬局方標準品〕

性状

�@　本品は、淡黄色の微細な結晶で、においはない。

�C　本品は、光によつて徐々に暗色となる。

純度試験

�@　融点　本品の融点は、２４５から２４７ﾟ（分解）でなければならない。

乾燥減量　０．５％以下（１ｇ，１０５ﾟ，４時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

チロシン　Ｃ_９Ｈ_１１ＮＯ_３〔日本薬局方標準品〕

性状

�A　融点　約２６０ﾟ（分解）

確認試験

乾燥減量　０．５％以下（１ｇ，減圧，五酸化リン，１１０ﾟ，１時間）

強熱残分　０．１０％以下（１ｇ）

注意：しや光した気密容器に保存する。

パラアミノベンゾイルグルタミン酸　Ｃ_１１Ｈ_１４Ｎ_２Ｏ_３〔日本薬局方標準品〕

葉酸　Ｃ_１９Ｈ_１９Ｎ_７Ｏ_６〔日本薬局方標準品〕

リボフラビン　Ｃ_１７Ｈ_２０Ｎ_４Ｏ_６〔日本薬局方標準品〕

(2) 試薬・試液

　試薬は、飼料添加物の試験に用いるものである。容量分析用標準試薬、特級、１級又は無ヒ素等と記載したものは、それぞれ日本工業規格試薬の容量分析用標準試薬、特級、１級又は無ヒ素等の規格に適合するものであり、かつ、試験法は、日本工業規格試薬の試験法に従う。試薬名が日本工業規格と相違する場合は、これを併記する。日局と記載したものは、日本薬局方の医薬品各条の成分規格に適合するものである。単に試験法を記載してある試薬については、飼料添加物の試験法を準用する。

　試液は、飼料添加物の試験に用いるために調製した液である。

　ビタミンＤ定量に用いるアセトンは、一般試験法のビタミンＤ定量法に定めるところによる。

純度　９６%以上

　ビタミンＤ定量に用いるものは、一般試験法のビタミンＤ定量法に定めるところによる。

　エタノール、クロロホルム、エーテル又はグリセリンにきわめて溶けやすく、水にやや溶けにくい。

　０．１ｍｏｌ／Ｌ臭素液１ｍＬ＝３．２１４０ｍｇＣ_６Ｈ_５ＣｌＯ

　０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬ＝０．０２２８１２ｇ（Ｏ_２Ｎ）_２Ｃ_６Ｈ_２（ＯＨ）ＣＯＯＨ

　この試液の蒸気はきわめて有毒であるから取り扱いに際し、吸入しないよう注意する。

　０．１ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸１ｍＬ＝４９．５６ｍｇＣ_１６Ｈ_１８Ｂｒ_２ＣｌＮ_３Ｏ_３

炭酸水素ナトリウム・メタノール試液　炭酸水素ナトリウム０.２５ｇにメタノール１，０００ｍＬを加えて溶かし、ろ過する。

　使用直前にＡ液、Ｂ液及び氷酢酸のそれぞれ等容量を混ぜて用いる。Ａ液及びＢ液はしや光して保存する。

　０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸銀液１ｍＬ＝５．８４４ｍｇＮａＣｌ

　０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸１ｍＬ＝１．７０３ｍｇＮＨ_３

消化度

　Ａ（％）＝（０．６００５×（ａ−ｂ）ｆ）／試料の量（ｇ）

　ｆ：０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム液のモル濃度係数

　１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム液１ｍＬ＝４９．０４ｍｇＨ_２ＳＯ_４

リン酸一水素カリウム　Ｋ_２ＨＰＯ_４〔リン酸二カリウム、特級〕

(3) 容量分析用標準液

　容量分析用標準液は、濃度が精密に知られた試薬溶液で、主として容量分析に用いるものである。

　容量分析用標準液にはモル液を用いる。溶液１，０００ｍＬ中に有効物質１グラム分子量を含む液が１モル液で、１ｍｏｌ／Ｌで表す。

　また、必要に応じて、それらを一定の割合に薄めた液を用いる。例えば、１ｍｏｌ／Ｌ溶液を１０倍容量に薄めたものは０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液である。

容量分析用標準液は、別に規定する場合を除き、無色又は遮光した共栓びんに入れ保存する。

調製

　容量分析用標準液は、次のいずれかの方法によつて調製し、モル濃度係数を定める。

　標定は、モル濃度係数を定める操作であり、標準物質を精密に量り、溶媒を加えて溶かし、未標定モル液で滴定し、そのモル濃度係数ｆを求める。

ｆ＝１０００ａ／（Ｖ×Ｅ×ｃ）

Ｅ：標準物質の分子量（ｇ）

ａ：標準物質の採取量（ｇ）

Ｖ：未標定モル液の消費量（ｍＬ）

ｃ：モル濃度

　直接に標準物質を用いない場合は、モル濃度係数既知のモル液を用いて未標定モル液を標定する。

ｆ２＝（Ｖ_１×ｆ_１）／Ｖ_２

ｆ_１：モル濃度係数既知のモル液のモル濃度係数

ｆ_２：未標定モル液のモル濃度係数

Ｖ_１：モル濃度係数既知のモル液の量（ｍＬ）